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Beneficio clínico de remdesivir en macacos rhesus infectados con SARS

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Nature, volumen 585, páginas 273–276 (2020)Citar este artículo

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Se necesitan con urgencia terapias eficaces para tratar la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Si bien se han sugerido muchos medicamentos en investigación, aprobados y reutilizados como tratamientos potenciales, los datos preclínicos de modelos animales pueden guiar la búsqueda de tratamientos efectivos al descartar aquellos que carecen de eficacia in vivo. Remdesivir (GS-5734) es un profármaco análogo de nucleótido con amplia actividad antiviral1,2 que actualmente se está investigando en ensayos clínicos de COVID-19 y recientemente recibió la Autorización de uso de emergencia de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.3,4. En modelos animales, remdesivir fue eficaz contra la infección por el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV)2,5,6. In vitro, remdesivir inhibió la replicación de SARS-CoV-27,8. Aquí investigamos la eficacia de remdesivir en un modelo de macaco rhesus de infección por SARS-CoV-29. A diferencia de los animales tratados con vehículo, los macacos tratados con remdesivir no mostraron signos de enfermedad respiratoria; también mostraron infiltrados pulmonares reducidos en radiografías y títulos de virus reducidos en lavados broncoalveolares doce horas después de la primera dosis. El tratamiento con remdesivir no redujo la eliminación del virus de las vías respiratorias superiores. En la necropsia, los animales tratados con remdesivir tenían cargas virales pulmonares más bajas y daño pulmonar reducido. Por lo tanto, el tratamiento con remdesivir iniciado temprano durante la infección tuvo un beneficio clínico en macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2. Aunque el modelo de macaco rhesus no representa la enfermedad grave observada en algunos pacientes con COVID-19, nuestros datos respaldan el inicio temprano del tratamiento con remdesivir en pacientes con COVID-19 para prevenir la progresión a neumonía.

Recientemente hemos establecido un modelo de macaco rhesus de infección por SARS-CoV-29. En este modelo, los macacos rhesus infectados desarrollan una enfermedad respiratoria transitoria de leve a moderada, con infiltrados pulmonares visibles en las radiografías y un patrón de excreción similar al observado en pacientes con COVID-19. Los signos clínicos observados y las altas cargas virales permiten probar la eficacia del tratamiento con antivirales de acción directa en este modelo.

Se inocularon dos grupos de seis macacos rhesus con la cepa nCoV-WA1-2020 del SARS-CoV-2. Doce horas después de la inoculación, a un grupo se le administró 10 mg kg-1 de remdesivir intravenoso y al otro grupo se trató con un volumen igual de solución de vehículo (2 ml kg-1). El tratamiento se continuó 12 h después del primer tratamiento y cada 24 h a partir de entonces con una dosis de 5 mg kg−1 de remdesivir o un volumen igual de solución vehículo (1 ml kg−1). La concentración de remdesivir se determinó en suero recogido 12 h después del tratamiento inicial y 24 h después de las dosis posteriores (inmediatamente antes de administrar la siguiente dosis de tratamiento). Remdesivir (profármaco GS-5734), su metabolito alanina corriente abajo (GS-704277) y el nucleósido original (GS-441524) se detectaron en el suero de todos los animales tratados con remdesivir (Datos ampliados Fig. 1a). Los niveles séricos del profármaco y los metabolitos posteriores fueron consistentes con los niveles plasmáticos publicados previamente de estos compuestos en macacos rhesus sanos, que mostraron una vida media sistémica corta para GS-5734 (0,39 h) que resultó en una conversión transitoria al intermedio GS-704277 y persistencia del producto GS-441524 corriente abajo a niveles plasmáticos más altos10.

Las concentraciones del metabolito GS-441524 se midieron en tejido pulmonar recolectado de cada lóbulo pulmonar siete días después de la inoculación (dpi) y 24 h después de administrar la última dosis de remdesivir; el metabolito fue fácilmente detectable en todos los animales tratados con remdesivir. GS-441524 se distribuyó generalmente en los seis lóbulos del pulmón (Datos extendidos, Fig. 1b). No se detectó GS-704277 en tejido pulmonar. Aunque el metabolito farmacológicamente activo de remdesivir es el trifosfato de GS-441524, las muestras de homogeneizado de pulmón enriquecidas con el metabolito trifosfato demostraron una rápida descomposición del metabolito en esta matriz (datos no mostrados). Los niveles de GS-441524 se tomaron como sustitutos de la carga tisular y sugieren que la estrategia de dosificación actual entregó metabolitos del fármaco en los sitios de replicación del SARS-CoV-2 en animales infectados.

Después de la inoculación con SARS-CoV-2, a los animales se les asignó una puntuación clínica diaria basada en una hoja de puntuación preestablecida de manera ciega. Doce horas después de la primera administración de remdesivir, las puntuaciones clínicas en los animales tratados con remdesivir fueron significativamente más bajas que en los animales de control que recibieron la solución de vehículo. Esta diferencia en la puntuación clínica se mantuvo durante todo el estudio (fig. 1a). Solo uno de los seis animales tratados con remdesivir mostró disnea leve, mientras que se observaron taquipnea y disnea en todos los controles tratados con vehículo (Tabla 1 de datos ampliados). Los infiltrados pulmonares radiográficos son una de las características distintivas de COVID-19 en humanos. Las radiografías tomadas en 0, 1, 3, 5 y 7 ppp mostraron una afectación del lóbulo pulmonar significativamente menor y una infiltración pulmonar menos grave en los animales tratados con remdesivir que en los tratados con vehículo (Fig. 1b, c).

a, puntajes clínicos diarios para animales infectados con SARS-CoV-2 y tratados con remdesivir (círculos rojos, n = 6) o solución vehículo (cuadrados negros, n = 6). b, Puntuaciones radiográficas acumulativas. Un veterinario clínico puntuó las radiografías ventrodorsales y laterales para determinar la presencia de infiltrados pulmonares de acuerdo con un sistema de puntuación estándar (0, normal; 1, infiltrados pulmonares intersticiales leves; 2, infiltrados pulmonares moderados, quizás con borramiento parcial del borde cardíaco y pequeñas áreas de inflamación pulmonar). consolidación; 3, infiltrados intersticiales severos, grandes áreas de consolidación pulmonar, patrones alveolares y broncogramas aéreos). Se puntuaron los lóbulos individuales y se totalizaron y visualizaron las puntuaciones por animal por día. c, Radiografías ventrodorsales de cada animal tomadas en 7 dpi. Las áreas de infiltración pulmonar están rodeadas. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak.

En 1, 3 y 7 dpi, se realizó lavado broncoalveolar (BAL) como indicador de replicación del virus en el tracto respiratorio inferior. Aunque las cargas virales en BAL se redujeron en animales tratados con remdesivir, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 2a). Sin embargo, 12 h después de administrar el primer tratamiento con remdesivir, el título de virus infeccioso en BAL fue aproximadamente 100 veces menor en los animales tratados con remdesivir que en los controles. A los 3 ppp, ya no se podía detectar el virus infeccioso en el LBA de los animales tratados con remdesivir, mientras que todavía se detectaba el virus en el LBA de cuatro de los seis animales de control (Fig. 2b). A pesar de esta reducción en la replicación del virus en el tracto respiratorio inferior, no hubo reducción en la carga viral o el título del virus infeccioso en frotis nasales, faríngeos o rectales recolectados de animales tratados con remdesivir, excepto por una diferencia significativa en el título del virus en frotis faríngeos recolectados en 1 dpi y en cargas virales en frotis de garganta recolectados en 4 dpi (Datos extendidos Fig. 2).

a, b, Cargas virales (a) y títulos de virus infecciosos en BAL (b) recolectados de macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2 y tratados con remdesivir (n = 6) o solución de vehículo (n = 6). TCID50, 50% de dosis infecciosa de cultivo tisular. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. c, Cargas virales en tejidos recolectados de los seis lóbulos pulmonares en la necropsia en 7 dpi de macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2 y tratados con remdesivir (n = 6) o solución de vehículo (n = 6). El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no pareada. Barras centrales, mediana.

Todos los animales fueron sacrificados en 7 dpi. Se recogieron muestras de tejido de cada lóbulo pulmonar para comparar la replicación del virus entre los animales tratados con remdesivir y los tratados con vehículo. En 10 de 36 muestras de lóbulo pulmonar recolectadas de animales tratados con remdesivir, no se pudo detectar el ARN viral, mientras que este fue el caso en solo 3 de 36 lóbulos pulmonares recolectados de animales de control. En general, la comparación entre lóbulos pulmonares individuales en los dos grupos mostró una media geométrica más baja de ARN viral en el grupo tratado con remdesivir (Datos ampliados, Fig. 3a). Juntos, estos datos muestran que la carga viral fue significativamente menor en los pulmones de los animales tratados con remdesivir que en los de los controles tratados con vehículo (Fig. 2c). El virus se pudo aislar de los lóbulos pulmonares de cinco de los seis animales de control tratados con vehículo, pero no de ninguno de los tejidos pulmonares recolectados de los animales tratados con remdesivir. Aunque la PCR cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR) mostró que menos tejidos de otras posiciones en el tracto respiratorio fueron positivos para el ARN viral en animales tratados con remdesivir que en los controles, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (Datos ampliados Fig. 3b).

En la necropsia a 7 dpi, los pulmones se evaluaron macroscópicamente en busca de lesiones. Se observaron lesiones pulmonares macroscópicas en uno de cada seis animales tratados con remdesivir. Por el contrario, los seis animales de control tratados con vehículo tenían lesiones visibles, lo que resultó en una diferencia estadísticamente significativa en el área de los pulmones afectada por las lesiones (Fig. 3a, b, Datos ampliados Fig. 4a, b). Esta diferencia también fue evidente cuando se calculó la relación peso pulmonar/peso corporal como indicador de neumonía; esta proporción fue significativamente menor en los animales tratados con remdesivir que en los tratados con vehículo (Datos ampliados, Fig. 4c). Histológicamente, los animales tratados con remdesivir tenían menos lesiones y menos graves que los controles tratados con vehículo. Las lesiones pulmonares histológicas estuvieron ausentes en tres de los seis animales tratados con remdesivir; los tres animales restantes desarrollaron patología pulmonar mínima. Las lesiones en estos animales se caracterizaron como neumonía intersticial mínima, muy separada, frecuentemente localizada en los espacios subpleurales (Fig. 3c, e). Cinco de los seis animales tratados con vehículo desarrollaron neumonía intersticial multifocal, de leve a moderada (Fig. 3d, f). Detectamos antígeno viral en pequeñas cantidades de neumocitos tipo I y tipo II y macrófagos alveolares en todos los animales, independientemente del tratamiento (Fig. 3g, h).

Los macacos Rhesus infectados con SARS-CoV-2 y tratados con remdesivir (izquierda, n = 6) o solución de vehículo (derecha, n = 6) fueron sacrificados en 7 dpi. a, b, vistas dorsales representativas de los pulmones de un animal tratado con remdesivir (a) y un animal tratado con vehículo con áreas focalmente extensas de consolidación (b, círculos). El análisis histológico se realizó en tres secciones de seis lóbulos pulmonares de cada uno de los seis animales por grupo de tratamiento y se eligieron imágenes representativas para c-h. c, Neumonía intersticial subpleural mínima (recuadro) observada en tres de los seis animales tratados con remdesivir. d, Neumonía intersticial subpleural moderada con edema (recuadro) observada en cinco de seis animales tratados con vehículo. e, área encuadrada de c con alvéolos revestidos por neumocitos tipo II (flecha) y espacios alveolares que contienen macrófagos espumosos (punta de flecha). f, área encuadrada de d con intersticio pulmonar expandido por edema y cantidades moderadas de macrófagos y neutrófilos. Los alvéolos están revestidos por neumocitos tipo II (flechas). Los espacios alveolares están llenos de edema (asterisco) y un pequeño número de macrófagos pulmonares (punta de flecha). g, Antígeno viral en neumocitos tipo I (flecha) y neumocitos tipo II (punta de flecha) de un animal tratado con remdesivir. h, Antígeno viral en neumocitos tipo I (flecha) y macrófagos (punta de flecha) de un animal tratado con vehículo. Barras de escala: c, d, 200 μm; e–h, 20 μm.

Realizamos con éxito una secuenciación profunda en muestras de todos los animales tratados con remdesivir y controles tratados con vehículo. No se detectaron mutaciones conocidas en la ARN polimerasa dependiente de ARN que confieren resistencia a remdesivir en coronavirus11 en ninguna de las muestras analizadas (Tabla complementaria 1).

Remdesivir es, hasta donde sabemos, el primer tratamiento antiviral que muestra eficacia comprobada contra el SARS-CoV-2 en un modelo animal de COVID-19. El tratamiento de macacos rhesus infectados con SARS-CoV-2 con remdesivir redujo la enfermedad clínica y el daño a los pulmones. La dosificación de remdesivir utilizada en macacos rhesus es equivalente a la utilizada en humanos; sin embargo, debido a la naturaleza aguda de la enfermedad en los macacos rhesus, es difícil traducir directamente el momento del tratamiento utilizado a las etapas correspondientes de la enfermedad en humanos. En nuestro estudio, el tratamiento se administró cerca del pico de replicación del virus en los pulmones según lo indicado por las cargas virales en los lavados broncoalveolares y los primeros efectos del tratamiento sobre los signos clínicos y la replicación del virus se observaron dentro de las 12 h. La eficacia de los antivirales de acción directa contra las infecciones virales agudas del tracto respiratorio generalmente disminuye con los retrasos en el inicio del tratamiento12. Por lo tanto, el tratamiento con remdesivir debe iniciarse lo antes posible en pacientes con COVID-19 para lograr el máximo efecto del tratamiento.

A pesar de la falta de signos respiratorios obvios y la reducción de la replicación del virus en los pulmones de los animales tratados con remdesivir, no hubo reducción en la eliminación del virus. Este hallazgo es muy importante para el manejo del paciente, donde una mejoría clínica no debe interpretarse como falta de infecciosidad. Aunque hemos demostrado que los metabolitos de remdesivir se encuentran en el tracto respiratorio inferior, los niveles del fármaco en el tracto respiratorio superior no se han caracterizado y se deben considerar formulaciones novedosas con rutas alternativas de administración del fármaco para mejorar la distribución al tracto respiratorio superior, reduciendo así la excreción. y el riesgo potencial de transmisión. Sin embargo, dado que la enfermedad grave por COVID-19 es el resultado de la infección viral de los pulmones, este órgano es el objetivo principal del tratamiento con remdesivir. La biodisponibilidad y el efecto protector de remdesivir en los pulmones de macacos rhesus infectados respaldan el tratamiento de pacientes con COVID-19 con remdesivir. El tratamiento con Remdesivir no resultó en una mejoría clínica en un ensayo clínico con pacientes con COVID-1913 grave; sin embargo, otro ensayo clínico que involucró a más pacientes mostró que el tratamiento con remdesivir resultó en un tiempo de mejora más corto que en los pacientes que recibieron solo atención estándar14. Nuestros hallazgos en macacos rhesus indican que el tratamiento con remdesivir debe considerarse tan pronto como sea clínicamente posible para prevenir la progresión a neumonía en pacientes con COVID-19.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Rocky Mountain Laboratories, NIH y llevados a cabo por personal certificado en una instalación acreditada internacionalmente por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC), de acuerdo con las pautas de la institución para uso de animales, siguiendo las pautas y los principios básicos de la Guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, la Ley de bienestar animal, el Departamento de agricultura de los Estados Unidos y la Política del servicio de salud pública de los Estados Unidos sobre el cuidado humanitario y el uso de animales de laboratorio. Los macacos Rhesus se alojaron en jaulas de primates individuales adyacentes, lo que permitió interacciones sociales, en una habitación climatizada con un ciclo fijo de luz y oscuridad (12 h de luz y 12 h de oscuridad). Los animales fueron monitoreados al menos dos veces al día durante todo el experimento. Personal capacitado proporcionó comida comercial para monos, golosinas y frutas dos veces al día. El agua estaba disponible ad libitum. El enriquecimiento ambiental consistió en una variedad de interacciones humanas, manipulanda, juguetes comerciales, videos y música. El Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) aprobó el trabajo con cepas infecciosas de SARS-CoV-2 en condiciones BSL3. La inactivación de la muestra se realizó de acuerdo con los procedimientos operativos estándar aprobados por IBC para la extracción de muestras de alta contención.

Para evaluar el efecto del tratamiento con remdesivir en el resultado de la enfermedad por SARS-CoV-2, utilizamos el modelo de macaco rhesus recientemente establecido de infección por SARS-CoV-2 que da como resultado una enfermedad transitoria del tracto respiratorio inferior9. Dado que este es un modelo con pocos datos previos, no fue posible realizar un análisis de potencia para determinar el tamaño del grupo. Por lo tanto, el tamaño de la muestra se basó en la experiencia con otros modelos de enfermedades respiratorias en primates no humanos, principalmente un modelo de macaco rhesus de MERS-CoV donde n = 6 arrojó significación estadística. Doce animales fueron asignados aleatoriamente a dos grupos e inoculados como se describió anteriormente con una dosis total de 2,6 × 106 TCID50 (50 % de la dosis infecciosa del cultivo de tejidos) de la cepa nCoV-WA1-2020 del SARS-CoV-2 por vía intranasal, oral, ocular e intratraqueal. rutas La eficacia del tratamiento terapéutico con remdesivir se probó en dos grupos de seis macacos rhesus adultos (tres machos y tres hembras cada uno; 3,6–5,7 kg). Debido a la naturaleza aguda del modelo SARS-CoV-2 en macacos rhesus, el tratamiento terapéutico se inició 12 h después de la inoculación con SARS-CoV-2 y continuó una vez al día durante 6 dpi. Un grupo de macacos rhesus se trató con una dosis de carga de 10 mg/kg de remdesivir, seguida de una dosis diaria de mantenimiento de 5 mg/kg. El otro grupo de seis animales sirvió como control infectado y se les administró un volumen de dosis igual (es decir, 2 ml/kg de dosis de carga y 1 ml/kg a partir de entonces) de solución de vehículo (sulfobutiléter-β-ciclodextrina al 12 % en agua y ácido clorhídrico , pH 3,5) según el mismo programa de tratamiento. Este esquema de dosificación en macacos rhesus imita la dosificación diaria probada en estudios clínicos con pacientes con COVID-19 y da como resultado una exposición sistémica similar al fármaco. El tratamiento se administró como una inyección intravenosa en bolo (dosis total administrada durante aproximadamente 5 minutos) administrada alternativamente en las venas cefálica o safena izquierda o derecha. Aunque el ciclo de tratamiento con remdesivir utilizado aquí en macacos rhesus es más corto que el ciclo estándar de 10 días en pacientes, se eligió este ciclo de tratamiento más corto para permitir la evaluación de la patología pulmonar en un momento posterior a la inoculación, cuando todavía estarían presentes los infiltrados pulmonares y la neumonía intersticial. Datos recientes de ensayos clínicos han demostrado que un ciclo de tratamiento de 5 días tiene un beneficio clínico similar al de un ciclo de tratamiento de 10 días en pacientes con COVID-1914.

Los animales se observaron dos veces al día para detectar signos clínicos de enfermedad usando una hoja de puntuación estandarizada como se describió anteriormente9; la misma persona, que desconocía la asignación de grupos de los animales, evaluó a los animales durante todo el estudio. El punto final predeterminado para este experimento fue de 7 ppp. Se recolectaron hisopos de nariz, garganta y recto diariamente durante la administración del tratamiento. Los exámenes clínicos se realizaron en 0, 1, 3, 5 y 7 dpi en animales anestesiados. Los días de examen se recogieron parámetros clínicos como peso corporal, temperatura, oximetría de pulso, presión arterial y frecuencia respiratoria, así como radiografías de tórax dorsoventral y lateral. Las radiografías fueron analizadas por un veterinario clínico cegado a la asignación de grupos de los animales. En 1, 3 y 7 dpi se realizó un LBA utilizando 10 ml de solución salina estéril. Después de la muerte en 7 dpi, se realizaron necropsias en los animales. El porcentaje de lesiones pulmonares macroscópicas fue calificado por un patólogo veterinario certificado por la junta que desconocía la asignación de grupos de los animales y se recolectaron muestras de los siguientes tejidos: ganglio linfático cervical, conjuntiva, mucosa nasal, orofaringe, amígdala, tráquea, todos los lóbulos pulmonares , ganglio linfático mediastínico, bronquio derecho e izquierdo, corazón, hígado, bazo, riñón, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon y vejiga urinaria. El análisis histopatológico de los portaobjetos de tejido fue realizado por un patólogo veterinario certificado por la junta que desconocía la asignación de grupos de los animales.

El aislamiento de SARS-CoV-2 nCoV-WA1-2020 (MN985325.1)15 (paso 3 de Vero) fue amablemente proporcionado por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) y se propagó una vez en células Vero E6 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma ) suplementado con suero bovino fetal al 2% (Gibco), l-glutamina 1 mM (Gibco), penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 μg/ml (Gibco) (medio de aislamiento del virus). El stock de virus utilizado era 100 % idéntico a la secuencia GenBank depositada inicial (MN985325.1) y no se detectaron contaminantes. Las células VeroE6 se mantuvieron en DMEM suplementado con suero de ternero fetal al 10%, l-glutamina 1 mM, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 µg/ml.

Remdesivir (RDV; GS-5734) fue fabricado en Gilead Sciences por el Departamento de Química de Procesos (Alberta, Canadá) bajo condiciones de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP). El lote número 5734-BC-1P se solubilizó en sulfobutiléter-β-ciclodextrina al 12 % en agua y se proporcionó una solución de vehículo equivalente a los NIH.

La tributilamina se adquirió de Millipore Sigma. El agua de grado LC-MS, la acetona, el metanol, el isopropanol y el ácido acético se adquirieron a través de Fisher Scientific. Todos los estándares sintéticos para el análisis molecular fueron proporcionados por Gilead Sciences Inc. El suero y los homogeneizados de pulmón aclarados se irradiaron con rayos gamma (2 MRad) para inactivar el virus infeccioso potencialmente presente en estas muestras antes del análisis. Las muestras se prepararon para el análisis de moléculas pequeñas diluyendo una alícuota de 50 μl de suero u homogeneizado de pulmón clarificado con 950 μl de acetona al 50 %, metanol al 35 %, agua al 15 % (v/v) en hielo. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min y luego se centrifugaron a 16 000 g durante 5 min. Los sobrenadantes clarificados (850 μl) se recuperaron y se llevaron a sequedad en un concentrador Savant DNA120 SpeedVac (Thermo Fisher). Las muestras se resuspendieron en 100 μl de metanol al 50 %, agua al 50 % (v/v) y se centrifugaron como antes. El sobrenadante se llevó a un vial de muestra para el análisis LC-MS. Las muestras se separaron utilizando una estrategia de cromatografía líquida de emparejamiento iónico en un sistema Sciex ExionLC AC. Las muestras se inyectaron en una columna Waters Atlantis T3 (100 Å, 3 μm, 3 mm × 100 mm) y se eluyeron usando un gradiente binario de tributilamina 5 mM, ácido acético 5 mM en isopropanol al 2 %, metanol al 5 %, agua al 93 % ( v/v) hasta isopropanol al 100 % durante 5,5 min. Los analitos se midieron utilizando un espectrómetro de masas Sciex 5500 QTRAP en modo negativo. Se realizó un seguimiento de reacciones múltiples utilizando dos pares de señales para cada analito y se confirmó la fidelidad de la señal mediante la recopilación de espectros de iones de productos desencadenados y la comparación con los espectros de estándares sintéticamente puros.

Todos los analitos se cuantificaron frente a una curva de calibración de ocho puntos del estándar sintético respectivo preparado en la matriz objetivo (es decir, suero u homogeneizado de pulmón limpio) y se procesaron de la misma manera que las muestras experimentales. El límite de cuantificación (LOQ) se aproximó a una señal de ruido de 10. Los LOQ para las moléculas medidas en cada matriz fueron 5 nM para GS-441524 tanto en homogeneizado de pulmón como en suero, 1 nM para GS-704277 tanto en homogeneizado de pulmón como en suero. suero y 0,08 nM para GS-5734 en suero. La inestabilidad de GS-5734 y el metabolito de nucleótido trifosforilado en el homogeneizado de pulmón durante la lisis del tejido impidió la detección de estos metabolitos en el tejido pulmonar.

El ARN se extrajo de hisopos y LBA utilizando el kit QiaAmp Viral RNA (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los tejidos (30 mg) se homogeneizaron en tampón RLT y el ARN se extrajo utilizando el kit RNeasy (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Para la detección de ARN viral, se usaron 5 μl de ARN en un ensayo de RT-PCR E en tiempo real de un solo paso16 utilizando el kit de sonda Rotor-Gene (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En cada ejecución, se ejecutaron en paralelo diluciones estándar de estándares de ARN contados por PCR digital de gotitas, para calcular el número de copias en las muestras.

Las titulaciones de virus se realizaron mediante titulación de punto final en células Vero E6. El tejido se homogeneizó en 1 ml de DMEM usando un TissueLyser (Qiagen). Las células se inocularon con diluciones en serie de diez veces de muestras de hisopos y LBA. El aislamiento del virus se realizó en tejidos pulmonares homogeneizando el tejido en 1 ml de DMEM e inoculando células Vero E6 en una placa de 24 pocillos con 250 µl de homogeneizado aclarado y una dilución 1:10 del mismo. Una hora después de la inoculación de las células, se retiró el inóculo y se reemplazó con 100 μl (titulación de virus) o 500 μl de medio de aislamiento de virus. Seis días después de la inoculación, se puntuó el CPE y se calculó la TCID50.

La histopatología y la inmunohistoquímica se realizaron en tejidos de macaco rhesus. Después de la fijación durante un mínimo de 7 días en formalina tamponada neutra al 10 % y la inclusión en parafina, las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Para detectar el antígeno del SARS-CoV-2, se realizó inmunohistoquímica con un antisuero de conejo hecho a medida contra el SARS-CoV-2 N a una dilución de 1:1000. Los portaobjetos teñidos fueron analizados por un patólogo veterinario certificado por la junta.

El ARN viral se extrajo como se describe anteriormente. Los ADNc se prepararon como se describe, con modificaciones menores17. En resumen, de 3 a 12 μl de ARN extraído se agotó el ARNr con Ribo-Zero Gold H/M/R (Illumina) y luego se transcribió de forma inversa con hexámeros aleatorios y SuperScript IV (ThermoFisher Scientific). Después del tratamiento con RNaseH, se realizó la síntesis de la segunda cadena utilizando el fragmento Klenow (New England Biolabs) y los ADNc de doble cadena resultantes se trataron con una mezcla combinada de RiboShredder RNase Blend (Lucigen) y RNase, DNase-free, high conc (Roche Diagnostics, Indianápolis). , IN) y luego se purificó utilizando la purificación de perlas Ampure XP (Beckman Coulter). Se utilizó el kit de preparación de bibliotecas HyperPlus de Kapa (Roche Sequencing Solutions) para preparar bibliotecas de secuenciación a partir de ADNc de doble cadena. Para facilitar la multiplexación, la ligadura del adaptador se realizó con adaptadores únicos de doble índice KAPA y las muestras se enriquecieron para obtener un producto ligado con adaptador utilizando la mezcla KAPA HiFi HotStart Ready y siete ciclos de amplificación de PCR, de acuerdo con el manual del fabricante. Se utilizaron grupos que constaban de ocho bibliotecas de muestras para el enriquecimiento de virus de captura híbrida utilizando el panel myBaits Expert Virus SARS-CoV-2 y siguiendo el manual del fabricante, versión 4.01, con 14 ciclos de amplificación por PCR posterior a la captura (Arbor Biosciences). Las bibliotecas enriquecidas y purificadas se cuantificaron con el kit Kapa Library Quantification (Roche Sequencing Solutions) y se secuenciaron como lecturas de 2 × 150 pares de bases en el instrumento Illumina NextSeq 550 (Illumina).

Las lecturas fastq sin procesar se recortaron de las secuencias del adaptador de Illumina con la versión 1.1218 de cutadapt y luego se recortaron y filtraron para determinar la calidad con FASTX-Toolkit (Hannon Lab). Las lecturas restantes se asignaron al genoma SARS-CoV-2 2019-nCoV/USA-WA1/2020 (MN985325.1) usando Bowtie2 versión 2.2.919 con parámetros --local --no-mixed -X 1500. Se eliminaron los duplicados de PCR usando picard MarkDuplicates (Broad Institute) y las variantes se llamaron usando GATK HaplotypeCaller versión 4.1.2.020 con el parámetro -ploidy 2. Las variantes se filtraron para QUAL> 1000 y DP> 20 usando bcftools.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 8.2.1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este documento.

Todos los datos incluidos en este manuscrito han sido depositados en Figshare (https://doi.org/10.35092/yhjc.12111570). Las secuencias se han depositado en NCBI con el número de acceso de BioProject PRJNA632475.

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