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Aug 02, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 366 (2023) Citar este artículo

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La plasticidad sináptica implica el establecimiento y la reorganización adecuados de los microdominios estructurales y funcionales. Sin embargo, la visualización de las señales de lípidos subyacentes resultó ser un desafío. Aplicando una combinación de criofijación rápida, fractura por congelación de membrana, marcaje con inmunooro y microscopía electrónica, visualizamos y determinamos cuantitativamente los cambios y la distribución de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) en la membrana plasmática de las espinas dendríticas y sus subáreas en resolución ultra alta. Estos esfuerzos desentrañan distintas fases de las señales de PIP2 durante la inducción de la depresión a largo plazo (LTD). Durante los primeros minutos, PIP2 aumenta rápidamente de manera dependiente de PIP5K formando nanoclusters. PTEN contribuye a una segunda fase de acumulación de PIP2. Las señales de PIP2 aumentadas transitoriamente están restringidas a las cabezas de la columna superior y media. Finalmente, la degradación de PIP2 dependiente de PLC proporciona la terminación oportuna de las señales de PIP2 durante la inducción de LTD. Juntos, este trabajo desentraña las señales espaciales y temporales establecidas por PIP2 durante diferentes fases después de la inducción de LTD y disecciona los mecanismos moleculares que subyacen a la dinámica de PIP2 observada.

La mayoría de las postsinapsis excitatorias del sistema nervioso central se localizan en pequeñas protuberancias dendríticas denominadas espinas dendríticas. Los procesos de plasticidad sináptica que implican cambios dinámicos en la estructura y organización de las espinas dendríticas subyacen a la modulación de la fuerza sináptica excitatoria y se cree que son la base del aprendizaje y la memoria1,2. Entre los modos de plasticidad sináptica destaca un proceso denominado depresión a largo plazo (LTD), que reduce la sensibilidad y la respuesta a una señal sináptica determinada3. A nivel molecular, LTD implica la eliminación de los receptores de glutamato de tipo α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) del andamio de densidad postsináptica por endocitosis o difusión lateral, así como reordenamientos estructurales de la citoesqueleto de actina que resulta en una reducción del volumen de la columna3,4.

Durante las últimas décadas, se ha logrado un gran progreso en la identificación y caracterización de los mecanismos proteicos que controlan y median la plasticidad de las espinas dendríticas. Sin embargo, el conocimiento sobre la participación de los lípidos de la membrana, aunque son los principales constituyentes de la membrana, aún es escaso y, a menudo, controvertido o incluso contradictorio5,6. Los fosfoinosítidos son conocidos por interactuar y regular distintas proteínas de membrana y tener una variedad de funciones celulares7. El fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P) y el fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (aquí, por simplicidad, denominados PIP2) son los fosfoinosítidos más abundantes en las células. PIP2 se enriquece en la membrana plasmática, donde constituye menos del uno por ciento de los fosfolípidos8. En las presinapsis, las funciones cruciales de los fosfoinosítidos han sido bien establecidas y comprenden principalmente funciones de tráfico de membranas9,10,11,12. Por el contrario, la importancia fisiológica y el papel específico de PIP2 en las postsinapsis son mucho menos conocidos y controvertidos.

Las concentraciones de fosfoinosítidos individuales están controladas por un conjunto complejo de fosfatasas, quinasas y lipasas lipídicas específicas que son a su vez dianas de una variedad de vías de señalización13,14. Los estudios que investigaron un papel putativo de PIP2, especialmente en LTD, se basaron en gran medida en la manipulación de estas enzimas metabólicas y arrojaron resultados contradictorios15,16,17,18,19,20. Las razones de las discrepancias (aparentes) pueden incluir en gran medida la incapacidad de fijar y visualizar directamente PIP2 en las espinas postsinápticas sin alterar su distribución y su disponibilidad inalterada como señal de lípidos.

Las sinapsis tienen demandas funcionales y estructurales particulares para la compartimentación, según lo establecido por distintos nanodominios de membrana. Además, estos nanodominios de membrana sináptica requieren la capacidad de adaptarse plásticamente durante los reordenamientos postsinápticos. Para seguir la hipótesis de que estos reordenamientos durante LTD podrían ser provocados por señales temporales y espaciales establecidas por la importante molécula de señalización PIP2, aplicamos criofijación rápida, fractura por congelación de membrana, marcaje con inmunooro y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para visualizar y evaluar cuantitativamente la distribución de PIP2 en la membrana plasmática de espinas dendríticas y en diferentes subáreas de la misma a ultra alta resolución. Por lo tanto, revelamos las señales espaciales y temporales establecidas por PIP2 durante diferentes fases después de la inducción de LTD y diseccionamos los mecanismos moleculares que subyacen a la dinámica de PIP2 observada.

Estudios previos que intentaron desentrañar las implicaciones de las señales de señalización de PIP2 en las membranas de las espinas dendríticas durante LTD arrojaron resultados contradictorios16,19. Dado que las discrepancias aparentes pueden haber sido causadas por la falta de preservación de la distribución de PIP2, por el apagado artificial de PIP2, por una resolución insuficiente y/o por otras limitaciones, nuestro objetivo fue establecer un inmunomarcaje anti-PIP2 de membranas fracturadas por congelación crioconservadas rápidamente analizado por TEM. Los liposomas con PIP2, fosfatidilserina (PS), PI(3,4,5)P3 (PIP3) o PI(3,4)P2 agregados se congelaron rápidamente en propano/etano enfriado con nitrógeno líquido, se fracturaron por congelación y se incubaron. con anti-PIP2 y anticuerpos secundarios acoplados con oro para determinar si es posible conservar y detectar el lípido señal PIP2 en un entorno de membrana. De hecho, los exámenes con microscopía electrónica de liposomas con PIP2 añadida mostraron un marcaje frecuente con inmunooro (29,32 partículas de oro/µm2), mientras que los liposomas de control no (Fig. 1a-d). Las evaluaciones cuantitativas mostraron que los liposomas con PIP2 agregado mostraron una densidad de marcado de inmunooro más de 12 veces mayor en comparación con los liposomas de control, que simplemente ofrecían un excedente de grupos de cabeza de lípidos cargados negativamente y no relacionados en forma de adición de PS (Fig. 1e; Fig. Suplementaria 1). Estos resultados demostraron claramente que, en principio, es posible detectar PIP2 crioconservada en un entorno lipídico intacto.

a Imágenes TEM representativas de réplicas de liposomas de fractura por congelación marcada con inmunooro anti-PIP2 compuestas de 65 % (p/v) de PE, 30 % (p/v) de PC y 5 % (p/v) de PI(4, 5)P2 (PIP2) (a), PS (b), PI(3,4,5)P3 (PIP3) (c), o PI(3,4)P2 (d). Las puntas de flecha resaltan ejemplos de etiquetas doradas. Barras, 200 nm. e Análisis cuantitativos de densidades de marcaje. PI(4,5)P2, n = 25; PS, n = 35; PI(3,4,5)P3, n = 21; PI (3,4) P2, n = 21 (para la presentación de gráficos de barras / puntos de los datos cuantitativos en e, consulte la Figura complementaria 1). f–o Imágenes TEM (f, f', f", h–j, l–n) y análisis cuantitativos (g, k, o) de marcajes de inmunooro anti-PIP2 de membranas plasmáticas de soma fracturadas por congelación (f, f ', f", g) y dendritas (h–n) de las neuronas del hipocampo (DIV14-16). Las evaluaciones de la superficie de control (cara E, hielo) (g–k) y los experimentos de control con anticuerpos desactivados para la unión específica mediante preincubación con liposomas que contenían PIP2 (i, k) demostraron la especificidad del etiquetado. ( l – o ) Experimentos cuantitativos adicionales con diferentes diluciones de anticuerpos anti-PIP2 que establecen una dilución de anticuerpos de 1: 100 que produce una detección saturada de PIP2. Barras, 200 nm. Soma P-cara, n = 20; soma cara E, n = 12; hielo, n = 14 ROI. Dendritas: cara P, n = 40; Cara E, n = 37; hielo, n = 41; apagar (cara P), n = 41 ROI. Dendritas (caras P) marcadas con diferentes diluciones de anticuerpos: 1:200, n = 78; 1:100, n = 78; 1:50, n = 82 ROI. Datos, media ± SEM de al menos dos ensayos independientes cada uno. Cálculos de significación estadística, ANOVA unidireccional/Prueba de comparación múltiple de Tukey (g), Kruskal-Wallis/Dunn (e, k, o). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. Para P < 0,0001, los valores P exactos no están disponibles. Otros valores P se informan directamente en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

Otros experimentos mostraron que ni PIP3 ni PI (3,4) P2 fueron reconocidos por los anticuerpos anti-PIP2 (Fig. 1c, d). Las densidades de etiquetado observadas en estos dos controles adicionales fueron muy bajas y no excedieron las de PS (Fig. 1e; Fig. 1 complementaria). Por lo tanto, ni los inosítidos en general ni los fosfoinosítidos que contienen todas las características antigénicas potenciales también están presentes en PIP2 pero ofrecen un fosfato adicional (PIP3) o un fosfoinosítido que muestra todas las características de PIP2 pero presenta un grupo fosfato en una posición diferente (PI(3,4) P2) fueron reconocidos por los anticuerpos anti-PIP2. La inmunodetección establecida era así claramente específica para PIP2.

Las determinaciones cuantitativas de las densidades de marcado con diferentes tamaños de anticuerpos secundarios recubiertos de oro coloidal mostraron que los inmunomarcajes anti-PIP2 de las membranas fracturadas por congelación no dependían en gran medida del tamaño de las partículas de oro (Fig. 2 complementaria). Esto estaba en consonancia con las observaciones previas de obstáculos estéricos bajos de sondas basadas en proteínas en membranas fracturadas por congelación21.

Aunque tienen una morfología delicada, las neuronas cultivadas que crecen en discos de zafiro pueden, en principio, ser crioconservadas y fracturadas por congelación, lo que permite el marcaje con inmunooro de proteínas asociadas a la membrana, como la proteína F-BAR sindapina I22,23 (PACSIN 1) y la Proteína N-Ank ankycorbin24 (RAI14). Las neuronas primarias de rata cultivadas durante 16 días (DIV16) en zafiro mostraron morfologías postsinápticas normales, incluidas dendritas, espinas dendríticas y subestructuras de las mismas22. Por lo tanto, probamos si la combinación de crioconservación, fractura por congelación, marcaje con inmunooro y TEM de proteínas de membrana podría expandirse sustancialmente a la detección del lípido señal PIP2 en su entorno de membrana celular natural (Fig. 1f-k). Los aumentos de gran potencia de las áreas de la membrana plasmática fracturada por congelación del soma mostraron un marcado inmunooro anti-PIP2 frecuente (Fig. 1f-f"). El marcado inmunooro se encontró en diferentes topologías de membrana y hasta cierto punto estaba agrupado. Los grupos de etiquetado detectado generalmente tenía un diámetro relativamente uniforme de no más de 100 nm y contenía un máximo de 10 etiquetas (Fig. 1f-f ").

El marcaje fue altamente específico, ya que la cara P (cara protoplásmica de la membrana plasmática fracturada) de la membrana que representa la interfaz citosólica mostró una densidad de marcaje promedio de 24,2 partículas de oro/µm2, mientras que las superficies de control intrínsecas dentro de la muestra mostraron una marcación muy baja. densidades (cara E del soma (cara exoplásmica de la membrana plasmática fracturada), 3,0/µm;2 hielo, 0,6/µm2) (Fig. 1g). Estas observaciones son consistentes con que PIP2 esté predominantemente presente en la hoja interna de la membrana plasmática25.

Sorprendentemente, en el mismo espécimen e inmunomarcajes, la densidad de marcaje de PIP2 de las áreas de la membrana dendrítica estaba muy por debajo del marcaje muy abundante en la membrana plasmática somática (Fig. 1h-k). En áreas de membrana dendrítica, la densidad de marcaje solo alcanzó 6,3 partículas/µm2. Por lo tanto, era solo aproximadamente una cuarta parte de la de las áreas de la membrana somática.

Es importante destacar que también esta detección de PIP2 dendrítica mucho más baja fue claramente específica, ya que tanto la cara E dendrítica como las superficies de hielo casi no mostraron etiquetado. Además, los experimentos de extinción de anticuerpos con liposomas que contienen PIP2 también dieron como resultado un etiquetado muy escaso de membranas plasmáticas dendríticas fracturadas por congelación (Fig. 1i-k).

Para estudiar de forma fiable la aparición, la intensidad, la dinámica y el decaimiento de las señales de PIP2 con una resolución ultraalta, a continuación era importante determinar la dilución del anticuerpo detectando la cantidad máxima de PIP2 sin una supuesta unión inespecífica debida al exceso de anticuerpos. Al incubar alícuotas de la misma réplica de fractura por congelación con diferentes diluciones de anticuerpos, observamos que la saturación se alcanzó a 1: 100 (Fig. 1l-o).

El etiquetado anti-PIP2 validado y optimizado nos permitió realizar a continuación exámenes cuantitativos de ultra alta resolución de localización de PIP2 imperturbada en áreas de membrana plasmática crioconservadas y fracturadas por congelación del eje dendrítico de neuronas hipocampales maduras. Como se demostró antes, en principio es posible preservar no solo las dendritas sino también las espinas dendríticas durante la fracturación por congelación y las preparaciones posteriores de muestras para microscopía electrónica y clasificarlas y asignarlas a las distintas subclases22. Centramos nuestros análisis cuantitativos en espinas de tipo hongo, es decir, en espinas con una cabeza claramente discernible, porque las espinas de hongo constituyen la gran mayoría de las espinas del cerebro, contienen estructuras postsinápticas maduras y, por lo tanto, son de suma importancia fisiológica1,2 (en los siguientes simplemente denominados espinas). Las espinas dendríticas afiligranadas que sobresalen de las dendritas y sus subestructuras se fracturaron por congelación con tasas suficientes y estaban inmunomarcadas con anti-PIP2 (Fig. 2a-c). Los análisis cuantitativos mostraron que la densidad de inmunomarcaje anti-PIP2 en las espinas muestreadas sistemáticamente (es decir, también se incluyeron perfiles cero) fue mayor (P = 0.0062) que la densidad de marcaje promedio de las áreas dendríticas adyacentes (Fig. 2d).

a–c Imágenes TEM (a, b) de una espina dendrítica marcada con inmunooro anti-PIP2 de una neurona del hipocampo fracturada por congelación (DIV16) con la espina delineada y la coloración transparente de la dendrita (azul), la base de la espina (verde), el cuello de la espina (amarillo) y la cabeza de la columna vertebral (rojo) (a), como se muestra esquemáticamente en c, y la imagen TEM sin procesar correspondiente (b). Barras, 200 nm. d, e Análisis cuantitativos de las densidades de marcado de inmunooro anti-PIP2 de las áreas de la membrana plasmática de la columna dendrítica frente a la columna dendrítica (d) y de las áreas subespinales (e), respectivamente. Datos, media ± SEM de 16 ensayos independientes; n = 159 ROI cada uno (dendrita, columna vertebral total, base de la columna, cuello y cabeza). Cálculos de significación estadística, Mann-Whitney (d) y Kruskal-Wallis/Dunn's (e). **P < 0,01; ****P < 0,0001. Para P < 0,0001, los valores P exactos no están disponibles. El otro valor P se informa en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

Dentro de las espinas, la cabeza de la espina mostró un fuerte enriquecimiento de PIP2 sobre el cuello y en particular la base (ambos P <0.0001; ****). La densidad media de inmunomarcaje anti-PIP2 en cabezas de columna en reposo fue de 6,5 ± 0,6 partículas/µm2 en comparación con 2,9 ± 0,7 partículas/µm2 y 4,6 ± 1,3 partículas/µm2 en la base y el cuello, respectivamente. La densidad de marcaje de PIP2 en la membrana plasmática de la cabeza de la columna fue más del doble que en las áreas de la base de la columna. (Figura 2e).

Estas sorprendentes diferencias revelaron que incluso en estado estacionario, específicamente las cabezas de las espinas dendríticas son áreas prominentes de las señales de PIP2 en el eje dendrítico de las neuronas maduras.

Inducción de LTD mediante incubaciones con N-metil-D-aspartato (NMDA) 50 µM durante un máximo de 3 min y silenciamiento presináptico (preincubación con tetrodotoxina (TTX) 2 µM)26,27,28,29,30,31 seguido de persecución El período en medio preacondicionado y la posterior congelación rápida en distintos marcos de tiempo demostraron que PIP2 se puede detectar en las dendritas y en las espinas dendríticas antes y después de la inducción de LTD (Fig. 3a-h). Las evaluaciones microscópicas electrónicas cuantitativas revelaron que, mientras que las densidades de etiquetado de PIP2 en las áreas dendríticas (incluso las que rodean las espinas dendríticas) no cambiaron significativamente con el tiempo (Fig. 3i), la membrana plasmática de las espinas dendríticas mostró un aumento rápido y estadísticamente significativo de PIP2 densidad (P = 0,0049 (**)) 2 min en la estimulación NMDA. Los niveles de PIP2 en las espinas dendríticas durante esta primera fase alcanzaron el 180% de los niveles de PIP2 antes de la inducción de LTD por NMDA (Fig. 3j).

Imágenes TEM a–h de espinas dendríticas marcadas con inmunooro anti-PIP2 (delineadas) de neuronas del hipocampo fracturadas por congelación (DIV14-16) en estado estacionario (0 min) y en diferentes momentos durante y después de la inducción LTD mediante incubación con NMDA 50 µM durante 3 min y posterior colocación de nuevo en medio preacondicionado. Barras, 200 nm. i–k Determinaciones cuantitativas de densidades de marcaje de inmunooro anti-PIP2 en diferentes momentos del tratamiento durante y después de la inducción de LTD determinadas en dendritas (i), en espinas totales (j) y en los tres subdominios de espinas diferentes (k) expresadas como porcentaje del promedio Densidad de etiquetado de los datos totales de la columna vertebral a los 0 min (estado estacionario) en cada ensayo. Tres fases aparentes de las respuestas de señalización de PIP2 en las espinas dendríticas durante y después de la inducción de LTD se resaltan mediante coloración (amarillo, fase 1, primer aumento rápido de la densidad de PIP2; verde, segunda fase de aumento de las señales de PIP2 en la membrana plasmática de la columna (cabeza) hasta se alcanza un máximo a los 10 min; azul, fase 3, posterior disminución de señales PIP2 en la columna vertebral (cabeza)). Para una comparación de datos absolutos para 0 y 3 + 7 min no normalizados a los controles respectivos con los datos correspondientes obtenidos de un experimentador independiente y no capacitado, consulte la Fig. 3 complementaria. (i – k) Datos, media ± SEM. 0 minutos, n = 159; 1 minuto, n = 36; 2 minutos, n = 53; 3 minutos, n = 49; 5 (3 + 2) min, n = 50; 10 (3 + 7) min, n = 59; 15 (3 + 12) min, n = 44; 30 (3 + 27) min, n = 35 ROI cada uno (dendrita; columna vertebral total; subdominios de columna, base, cuello y cabeza) de 3 a 16 ensayos independientes con diferentes tiempos de incubación. Cálculos de significación estadística, pruebas de Kruskal-Wallis/Dunn (i-k; **P < 0,01; ****P < 0,0001) y de Mann-Whitney para 3 vs. 10 min y 10 vs. 30 min (j; ## P < 0,01) (j). Para P < 0,0001, los valores P exactos no están disponibles. Otros valores P se informan directamente en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

Esta primera fase fue seguida por un segundo aumento más lento en los niveles de PIP2 que alcanzó su punto máximo 10 minutos después del inicio de la inducción LTD. Sobre la columna vertebral total, el máximo de esta segunda fase estuvo marcado por señales de PIP2 que eran más del doble (220%) que los niveles de PIP2 en estado estacionario (Fig. 3j). Este hallazgo clave fue confirmado posteriormente por evaluaciones adicionales realizadas por un experimentador independiente. Es importante destacar que tales esfuerzos condujeron a prácticamente los mismos datos para la selección de la columna vertebral, las determinaciones del área de la columna vertebral y los recuentos de etiquetado y, por lo tanto, también produjeron datos prácticamente idénticos de densidades de etiquetado (Fig. 3 complementaria).

A partir de entonces, los niveles de PIP2 cayeron. Después de 30 minutos, casi alcanzaron los niveles de pretratamiento. Esta disminución constituyó así otra, una tercera fase distinta de las señales PIP2 tras la inducción de LTD en las espinas dendríticas (Fig. 3j).

Curiosamente, investigaciones espaciales más detalladas revelaron que era exclusivamente la membrana de la cabeza de la columna, pero no las áreas de la membrana de la base de la columna o el cuello, las que mostraban los aumentos de los niveles de PIP2 durante las fases 1 y 2 cuando se normalizaban a los respectivos datos de 0 min ( Figura 3k). En la membrana de la cabeza de la columna, la densidad de etiquetado de PIP2 fue más del 230 % de los niveles de estado estacionario durante la fase 1 y más de tres veces mayor durante la fase 2 (Fig. 3k).

La base de la columna y las áreas de la membrana dendrítica que rodean la columna mostraron cierta tendencia hacia un aumento de los niveles de PIP2, lo que indica cierta difusión 2D de PIP2 fuera de las áreas de la membrana de la columna durante la fase tardía de la inducción de LTD, pero ambas tendencias fueron menores y se mantuvieron estadísticamente. insignificante (Fig. 3i, k). La disminución general de los niveles de PIP2 en la columna vertebral total en la fase 3 (Fig. 3j) se atribuyó predominantemente a los cambios de los niveles de PIP2 en la cabeza de la columna. Treinta minutos después del inicio de la inducción LTD, los niveles de PIP2 en las membranas de la cabeza de la columna volvieron a los niveles previos al tratamiento (Fig. 3k).

La cabeza de la columna sufre varios cambios estructurales durante la LTD, que se cree que potencialmente involucran diferentes subdominios de la columna. Al medir la altura de cada cabeza de la columna vertebral y dividirla en tres zonas igualmente anchas (Fig. 4a), se reveló que la distribución de las señales de PIP2 no era igual, pero mostraba comportamientos y cinéticas muy distintos en los tres subdominios de la cabeza. Se pudo observar un aumento prominente de PIP2 después del tratamiento con NMDA en la parte superior de la cabeza (Fig. 4b). Las señales PIP2 aumentaron rápidamente a alrededor del 250 % de las que estaban en estado estable durante la primera fase. Continuaron aumentando a más del 350% durante la segunda fase. De manera similar, se observaron aumentos fuertes de los niveles de PIP2 en el área media de la cabeza (Fig. 4c; Fig. 3k, l complementaria).

Las cabezas de la columna vertebral se subdividieron en cabeza inferior, media y superior de acuerdo con el esquema (a). Análisis cuantitativos de las densidades de etiquetado de PIP2 en las neuronas DIV14-16 después del tratamiento con NMDA (ver Fig. 3) en la cabeza superior (b), media (c) e inferior (d). Los análisis cuantitativos se basan en los datos de la columna vertebral total a los 0 min (estado estable) en cada ensayo. Para una comparación de los datos absolutos para 0 y 3 + 7 min no normalizados a los controles respectivos con los datos correspondientes obtenidos de un experimentador independiente no capacitado, consulte la Fig. 3 complementaria. 0 min, n = 159; 1 minuto, n = 36; 2 minutos, n = 53; 3 minutos, n = 49; 5 (3 + 2) min, n = 50; 10 (3 + 7) min, n = 59; 15 (3 + 12) min, n = 44; 30 (3 + 27) min, n = 35 ROI cada uno (cabeza superior, media e inferior) de 3 a 16 ensayos independientes con diferentes tiempos de incubación. Datos, media ± SEM. Cálculos de significancia estadística, Kruskal-Wallis/Dunn's. *P < 0,05; ** P < 0,01. Los valores de p se informan directamente en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

La cinética de las áreas de la membrana de la cabeza de la columna superior fue única, ya que mostraron un aumento relativamente continuo de los niveles de PIP2 durante las fases 1 y 2 (Fig. 4b-d). Además, la caída de los niveles de PIP2 en la fase 3 alcanzó niveles mucho más bajos en la cabeza media e inferior en comparación con los datos del compartimento de la membrana de la cabeza de la columna superior (Fig. 4b-d).

Estas observaciones sugirieron que la cinética de PIP2 asociada a LTD difiere en los subcompartimentos de las cabezas de las espinas. El aumento en las áreas de la membrana de la cabeza de la columna superior y media puede reflejar la importancia de PIP2 en la regulación de la disponibilidad de los receptores AMPA en el PSD y/o el inicio de cambios estructurales en la cabeza de la columna.

Se ha sugerido que PIP2 participa en el anclaje de los receptores AMPA sinápticos y/o en la endocitosis de los receptores AMPA32. Lamentablemente, el establecimiento de marcajes de doble inmunooro de los receptores AMPA y/o NMDA, así como de diferentes componentes endocíticos, como la clatrina y la dinamina, así como de proteínas de andamiaje postsinápticos, como las proteínas PSD95 y ProSAP/Shank, junto con el exitoso PIP2 la detección no tuvo éxito. En consonancia con estas dificultades, tanto los receptores NMDA como los AMPA se detectaron en el lado extracelular después de la fabricación de la membrana33,34,35,36,37 y las dificultades para detectar proteínas, que están meramente indirecta o periféricamente asociadas a las membranas pero no insertadas, son probablemente debido al procedimiento de preparación de la muestra, que proporciona acceso total a la membrana al eliminar dicho material de manera efectiva. Los procesos biológicos celulares que involucran la señalización de PIP2 presumiblemente se basarían en algún tipo de nanodominios enriquecidos con PIP2 en las membranas de la columna vertebral. De hecho, pudimos observar grupos de PIP2 en membranas plasmáticas crioconservadas y fracturadas por congelación de neuronas cultivadas (Fig. 5a).

una imagen TEM de ejemplo de una columna vertebral crioconservada, fracturada por congelación y marcada con inmunooro anti-PIP2 de una neurona primaria del hipocampo tratada con NMDA durante 3 min. Las señales anti-PIP2 agrupadas (n ≥ 3 partículas de oro en un ROI circular con un diámetro de 100 nm) y (más) dispersas en la cabeza de la columna vertebral están marcadas con círculos y una punta de flecha, respectivamente. Barra, 200nm. b Cuantificación de la distribución de etiquetas de inmunooro anti-PIP2 en las cabezas de las espinas que se encuentran dentro de un grupo en comparación con las etiquetas fuera de cualquier grupo (en porcentaje del etiquetado total encontrado en la membrana de la cabeza de las espinas). Tenga en cuenta el aumento transitorio en el agrupamiento de 2 y 3 minutos en el tratamiento con NMDA. Datos, media ± SEM. 0 minutos, n = 159; 1 minuto, n = 36; 2 minutos, n = 53; 3 minutos, n = 49; 5 (3 + 2) min, n = 50; 10 (3 + 7) min, n = 59; 15 (3 + 12) min, n = 44; 30 (3 + 27) min, n = 35 ROI (cabeza de columna) cada uno de 3 a 16 ensayos independientes con diferentes tiempos de incubación. ANOVA bidireccional/prueba de comparación múltiple de Šídák (comparaciones a 0 min). *P < 0,05; *** P < 0,001. Los valores de p se informan directamente en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

Tanto la frecuencia de tales agrupaciones como la fracción relativa de PIP2 agrupada fue baja en estado estacionario pero aumentó fuertemente cuando las neuronas se estimularon con NMDA. Los análisis cuantitativos detallados de las cabezas de las espinas revelaron que solo el 22,4% de todas las etiquetas anti-PIP2 se detectaron dentro de los grupos en estado estacionario (Fig. 5b; 0 min). Por el contrario, tan pronto como a los 2 minutos del tratamiento con NMDA, el 57, 6% de todas las etiquetas de PIP2 se encontraron dentro de los grupos (Fig. 5b; 2 minutos).

Sorprendentemente, la agrupación de PIP2 parecía ser principalmente un fenómeno temprano y de corta duración del rápido aumento de PIP2 en las cabezas de las espinas, ya que la aparición estadísticamente significativa y predominante de PIP2 dentro de los nanodominios de membrana de menos de 100 nm de diámetro (la mayoría tenía alrededor de 50 nm). ) se observó exclusivamente 2 min y 3 min después del inicio de la inducción LTD (Fig. 5b).

Sorprendentemente, solo unos minutos después de la conclusión del tratamiento con NMDA, la PIP2 ahora fuertemente elevada en la cabeza de la columna vertebral (comparar con la Fig. 3k) se distribuyó de manera mayoritariamente dispersa, similar a la distribución en estado estacionario (Fig. 5b; compare una distribución similar de 0 min frente a 3 + 2 min y 3 + 7 min, respectivamente). Además, la última fase que refleja la disminución de los niveles de PIP2 después de la inducción de LTD (15 y 30 min) no mostró ninguna alteración estadísticamente significativa en la agrupación de PIP2 (Fig. 5b).

La segunda fase de la señalización de PIP2 inducida por LTD, que está marcada por los niveles más altos de PIP2 en las cabezas de las espinas dendríticas (Figs. 3, 4), mostró una distribución completamente diferente de PIP2 en comparación con la fase inicial de inducción de LTD.

Se ha demostrado que el homólogo de fosfatasa y tensina eliminado en el cromosoma 10 (PTEN) se recluta en el PSD después de la inducción de LTD y se sugirió que las señales de PIP2 durante LTD se generan mediante la desfosforilación de PIP317 (Fig. 6a). Los compuestos de bisperoxovanadio inhiben las proteínas tirosina fosfatasas, pero especialmente bpV (HOpic) mostró una selectividad por PTEN a bajas concentraciones38. Para obtener información sobre los mecanismos moleculares detrás de las acumulaciones de PIP2 en las espinas dendríticas, observamos en las diferentes fases de las señales de PIP2 durante la inducción de LTD, por lo tanto, examinamos las neuronas incubadas con el inhibidor de PTEN bpV (HOpic) durante 60 minutos antes de la inducción de LTD con NMDA ( Fig. 6b–j).

un esquema que visualiza rutas sugeridas hacia PIP2 durante LTD y la inhibición por bpV (HOpic). b–g Imágenes TEM representativas de espinas dorsales crioconservadas, congeladas y marcadas con inmunooro anti-PIP2 de neuronas del hipocampo DIV14-16 pretratadas durante 60 min con ddH2O como control de vehículo (b–d) o con 15 nM bpV (HOpic ) (e–g) y sometido a LTD inducido por NMDA durante 2 min (c, f) y durante 3 min de NMDA seguido de 7 min de tiempo de postincubación (d, g) en comparación con los controles no tratados con NMDA (0 min) (ser). Barras, 200 nm. h Análisis cuantitativos de la densidad de marcaje anti-PIP2 en neuronas pretratadas con bpV(HOpic) en comparación con las neuronas tratadas simplemente con ddH2O (−bpV(HOpic)) en los mismos ensayos que no revelaron ningún efecto estadísticamente significativo de la inhibición de PTEN en los niveles basales de PIP2 . Las densidades de marcaje se normalizaron al respectivo control -bpV(HOpic). i, j Análisis cuantitativos de la señalización de PIP2 durante la primera y segunda fase de la inducción de LTD en la columna vertebral total (i) y en la cabeza de la columna vertebral (j), respectivamente, (ambos normalizados a los respectivos datos de 0 min para las densidades de etiquetado de columna total de cada una de las dos condiciones, es decir, con y sin inhibidor). Datos, media ± SEM. −bpV(HOpic), 0 min, n = 39; 2 minutos, n = 29; 10 (3 + 7) min, n = 33 ROI cada uno (total de espinas dorsales; cabezas de espina dorsal) y +bpV (HOpic), 0 min, n = 33; 2 minutos, n = 30; 10 (3 + 7) min, n = 27 ROI cada uno (total de espinas; cabezas de espinas) de neuronas primarias de 3 ensayos independientes. Mann-Whitney (h); ANOVA bidireccional/comparación múltiple de Bonferroni entre condiciones de ±bpV(HOpic) (i, j). *P < 0,05. Se realizaron comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis/Dunn adicionales para comparar los datos de + y −bpV(HOpic) a los 2 min ya los 3 + 7 min a 0 min de datos de control (i, j) #P < 0,05; ##P < 0,01. Los valores de p se informan directamente en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

En estado estacionario (0 min), los tratamientos con bpV(HOpic) no dieron como resultado niveles de PIP2 significativamente diferentes en las espinas dendríticas en comparación con el pretratamiento con control de solvente (ddH2O; −bpV(HOpic) (Fig. 6h). También la PIP2 elevada los niveles de la primera fase (representados por 2 min de tratamiento con NMDA) no se vieron afectados por la inhibición de PTEN en las áreas de la membrana plasmática total de la columna (Fig. 6i; 235% del estado estacionario; P = 0.0148) y en las áreas de la membrana plasmática de la cabeza de la columna (Fig. .6j, 269% del estado estacionario, P = 0,0321).

En contraste con la primera fase insensible a bpV (HOpic) de la dinámica de PIP2 de la inducción de LTD, la segunda fase de la dinámica de PIP2 (representada por 3 min NMDA + 7 min) resultó verse afectada por la inhibición de PTEN. Si bien la densidad de PIP2 en las membranas de la columna vertebral de las neuronas no sujetas a la inhibición de PTEN fue del 246% de los niveles de PIP2 en estado estacionario y, por lo tanto, fue estadísticamente significativamente diferente del valor de 0 min (P = 0.0020) (Fig. 6i), los niveles de PIP2 en el la membrana plasmática de las espinas dendríticas de las neuronas preincubadas con inhibidor de PTEN a 3 + 7 min se parecía bastante a los datos de 0 min (Fig. 6i).

Los efectos inhibidores de bpV(HOpic) en la segunda fase de la dinámica de PIP2 fueron especialmente evidentes en las membranas de la cabeza de la columna vertebral. Aquí, los niveles de PIP2 se elevaron fuertemente en las neuronas de control no tratadas con inhibidores a los 3 + 7 min en comparación con 0 min (Fig. 6j; 297%; P = 0.0131). Por el contrario, en las neuronas pretratadas con bpV (HOpic), los niveles de PIP2 a los 3 + 7 min fueron solo alrededor del 150% de los datos de 0 min y, por lo tanto, fueron significativamente diferentes desde el punto de vista estadístico de los datos de aproximadamente el doble de 3 + 7 min obtenidos en la cabeza de la columna vertebral. áreas de membrana de las neuronas no sujetas a la inhibición de PTEN (Fig. 6j; P = 0.0259).

Por lo tanto, mientras que la fase inicial de las señales de PIP2 en la inducción de LTD es completamente independiente de los suministros de PIP2 por desfosforilación de PIP3, la actividad enzimática de PTEN contribuye específicamente a la segunda fase de acumulación de PIP2 mediada por LTD en las cabezas de las espinas dendríticas.

En eucariotas, PIP2 se genera con frecuencia por fosforilación de PI4P por fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinasas (PI4P5Ks/PIP5Ks) (Fig. 7a). Entre las diversas isoenzimas de PIP5K, PIP5Kγ muestra una alta expresión en el cerebro39. UNC3230 inhibió selectivamente PIP5Kγ40 en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal y es el único inhibidor comercialmente disponible de PIP5K. Por lo tanto, usamos UNC3230 para diseccionar aún más la fuente de PIP2 durante las diferentes fases de las señales de PIP2 durante la inducción de LTD (Fig. 7b-g). El pretratamiento de las neuronas del hipocampo durante 16 h con 500 nM UNC3230 no produjo ningún efecto estadísticamente significativo en los niveles de PIP2 en estado estacionario (t = 0 min) en comparación con el control de solvente (Fig. 7h).

un esquema que visualiza rutas sugeridas hacia PIP2 durante LTD y la inhibición por el inhibidor de PIP5K UNC3230. Imágenes TEM b-g de espinas dendríticas de espinas fracturadas por congelación inmunomarcadas con anti-PIP2 de neuronas del hipocampo DIV14-16, que fueron pretratadas con control de vehículo (0.002% DMSO) (-UNC3230, b-d) o con 500 nM UNC3230 ( p. ej., antes de inducir LTD con 2 min de NMDA (50 µM) o con 3 min de NMDA y 7 min de tiempo de recuperación (3 + 7 min), respectivamente, o de criopreservar las células en estado estacionario (0 min). Barras, 200 nm. h Los análisis cuantitativos de la densidad de marcaje anti-PIP2 de las neuronas +UNC3230 y −UNC3230 en estado estacionario se normalizaron con respecto al control no tratado respectivo. i, j Análisis cuantitativos de la dinámica de PIP2 que revelan un impacto negativo muy fuerte de la inhibición de PIP5K tanto en la primera fase (2 min) como en la segunda (3 + 7 min) de señales elevadas de PIP2 durante la inducción de LTD. Datos, media ± SEM. −UNC3230, 0 minutos, n = 62; 2 minutos, n = 46; 10 (3 + 7) min, n = 35 ROI cada uno (total de lomos; cabezas de lomo) y + UNC3230, 0 min, n = 50; 2 minutos, n = 40; 10 (3 + 7) min, n = 34 ROI cada uno (total de espinas; cabezas de espinas) de neuronas primarias de 3 ensayos independientes. Mann-Whitney (h; ns); ANOVA bidireccional/comparación múltiple de Bonferroni entre condiciones de ±UNC3230 (i, j) *P < 0,05; ** P < 0,01. Comparación múltiple adicional de Kruskal-Wallis/Dunn para comparar los datos de +UNC3230 y −UNC3230 a los 2 min y los datos de control de 3 + 7 min a 0 min (i, j)#.P < 0,05; ##P < 0,01. Los valores de p se informan directamente en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

Por el contrario, la inhibición de PIP5Kγ dio como resultado un bloqueo completo del aumento de PIP2 durante la primera (2 min) y la segunda fase (3 + 7 min) de la dinámica de PIP2 durante la inducción de LTD. Este bloqueo eficiente de la acumulación de PIP2 inducida por LTD durante ambas fases se destacó por diferencias claras y estadísticamente significativas entre las condiciones + y −UNC3230. El deterioro completo de la dinámica de PIP2 inducida por LTD en las espinas dendríticas fue obvio independientemente de si se examinó la columna total (Fig. 7i) o exclusivamente las áreas de la membrana de la cabeza de la columna (Fig. 7j). En todas las condiciones de +UNC3230, los niveles de PIP2 permanecieron iguales al estado estable (0 min) (Fig. 7i, j).

Por lo tanto, PIP5Kγ claramente es fundamental en la generación de PIP2 durante la inducción de LTD inducida por NMDA y, en contraste con la contribución selectiva de fase 2 de PTEN, PIP5Kγ es absolutamente fundamental durante las dos fases iniciales de las señales de PIP2 durante la inducción de LTD identificada en nuestros análisis cuantitativos.

Para comprender la dinámica de PIP2 inducida por LTD en las espinas dendríticas, fue importante investigar los mecanismos moleculares que provocan la eliminación efectiva de PIP2 de las áreas de la membrana plasmática de las espinas dendríticas en la fase tres de la dinámica de PIP2 durante la inducción de LTD. Además de la difusión de PIP2 desde las áreas de la cabeza de la columna vertebral, varias enzimas catalizan reacciones que convierten a PIP2. Lo más destacado es que la fosfolipasa C (PLC) escinde PIP2 en diacilglicerina (DAG) e inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) (Fig. 8a). Por lo tanto, tratamos las neuronas primarias del hipocampo con el inhibidor de PLC U-7312241 en comparación con el control de solvente (dimetilsulfóxido (DMSO)) y examinamos los niveles de PIP2 con y sin inducción de LTD (Fig. 8b-j). U-73122 no condujo a ninguna alteración de las densidades de etiquetado de PIP2 antes de la inducción de LTD (Fig. 8h) ni alteró el rápido aumento de los niveles de PIP2 durante las fases iniciales de la inducción de LTD, ya que incluso después de 10 min (3 + 7 min ) Los niveles de PIP2 se mantuvieron similares a los de las espinas dendríticas y las cabezas de las espinas dendríticas no tratadas con inhibidor, respectivamente (Fig. 8i, j).

un esquema que visualiza la degradación de PIP2 que produce DAG + IP3 y la inhibición por el inhibidor de PLC U-73122. Imágenes TEM b-g de espinas dendríticas de espinas fracturadas por congelación inmunomarcadas con anti-PIP2 de neuronas del hipocampo DIV14-16, que simplemente fueron pretratadas con control de vehículo (0.2% DMSO) (-U-73122, b-d) o con 10 µM U-73122 (e-g) antes de inducir LTD por 3 min NMDA y 7 min de tiempo de recuperación (3 + 7 min) y por 3 min NMDA y 27 min de tiempo de recuperación (3 + 27 min), respectivamente, o dejando las células en estado estacionario (0 min). Barras, 200 nm. h Los análisis cuantitativos de la densidad de marcaje anti-PIP2 de las neuronas + U-72122 y −U-73122 en estado estacionario se normalizaron con respecto al control no tratado respectivo. (i, j) Análisis cuantitativos de la dinámica de PIP2 que demuestran que la inhibición de PLC no tiene efecto en los niveles de PIP2 durante la segunda fase (3 + 7 min) de la inducción de LTD, pero bloquea por completo la restauración de los niveles de PIP2 en estado estacionario durante la tercera fase (3 + 27 min) de dinámica PIP2 durante la inducción LTD. Datos, media ± SEM. −U-73122, 0 minutos, n = 28; 3 + 7 min, n = 27; 3 + 27 min, n = 32 ROI cada uno (total de espinas dorsales; cabezas de espina dorsal) y +U-73122, 0 min, n = 27; 3 + 7 min, n = 25; 3 + 27 min, n = 26 ROI cada uno (total de espinas; cabezas de espinas) de neuronas primarias de 3 ensayos independientes. Mann-Whitney (h; ns); ANOVA bidireccional/comparación múltiple de Bonferroni entre las condiciones de ±U-73122 (i, j). *P < 0,05; ** P < 0,01. Pruebas adicionales de Mann-Whitney para comparaciones de datos de +U-73122 y −U-73122 a 3 + 7 min y 3 + 27 min a 0 min de datos de control (i, j). #P < 0,05; ##P < 0,01; ###P < 0,001. Los valores de p se informan directamente en la figura. Para obtener datos de origen numérico, consulte Datos complementarios 1.

Por el contrario, la tercera fase de la señalización de PIP2 durante la inducción de LTD resultó ser completamente dependiente de la actividad de PLC. Mientras que después de 30 minutos, las áreas de la membrana plasmática de la columna dendrítica de control y las áreas de la membrana de la cabeza de la columna de control mostraron una reversión completa del aumento transitorio de PIP2 inducido por LTD, la inhibición de PLC con U-73122 bloqueó completamente esta disminución. A los 30 minutos, las densidades de etiquetado anti-PIP2 tanto en las áreas de la membrana plasmática total de la columna como en las áreas de la membrana de la cabeza de la columna persistieron en niveles muy elevados (Fig. 8i, j).

Estos resultados revelaron claramente que las señales de PIP2 inducidas por LTD en la membrana de la cabeza de la columna dendrítica son terminadas activamente por la degradación de PIP2 por PLC. En conjunto, nuestros datos revelan un aumento transitorio de las señales de PIP2 en la membrana plasmática de las espinas dendríticas, resalta la cinética de estas señales y revela los mecanismos moleculares que desempeñan un papel crucial en la dinámica de las señales de PIP2 inducidas por LTD en las áreas de la membrana de la cabeza de la columna.

Las señales de señalización que emanan de los fosfoinosítidos se consideran aspectos clave para una variedad de funciones celulares; sin embargo, estas señales temporales y espaciales son muy difíciles de visualizar y estudiar en las membranas celulares. Aquí, describimos, según nuestro conocimiento, la primera inmunodetección de ultra alta resolución de PIP2. Nuestros análisis proporcionan la información espacial y temporal cuantitativa sobre PIP2 en la membrana plasmática del compartimento postsináptico de las células neuronales que se requiere para seguir las señales de PIP2 en la plasticidad sináptica. Sorprendentemente, en comparación con los niveles de PIP2 encontrados en áreas de la membrana plasmática del soma de las neuronas, que estaban en línea con abundantes detecciones de PIP2 utilizando proteínas de fusión GST purificadas del dominio PH de PLC en células no neuronales21,42,43, el PIP2 los niveles en la membrana plasmática del árbol dendrítico eran generalmente muy bajos. En el compartimento dendrítico, PIP2 parece actuar como señal de señalización de buena fe.

Usando microscopía de luz y el dominio PH de PLC que apaga PIP2 como una sonda de proteína, Horne y Dell'Acqua16 sugirieron que PIP2 está fuertemente enriquecido en las espinas dendríticas en comparación con las dendritas. Nuestras determinaciones cuantitativas mostraron que, mediante el uso de métodos de fractura por congelación, este enriquecimiento de PIP2 en las espinas dendríticas en estado estacionario, de hecho, es pequeño. Nuestros exámenes con microscopio electrónico revelaron que exclusivamente las membranas de la cabeza de la columna vertebral mostraron un fuerte enriquecimiento (alrededor de +40%) sobre los niveles generales de dendritas.

Aunque se han aplicado métodos de superresolución para la detección de PIP2 en células PC1244,45, la microscopía óptica tiene un uso limitado para correlaciones detalladas con subestructuras de espinas dendríticas en células neuronales, ya que estas subestructuras son muy pequeñas. Es importante destacar que la expresión exógena de proteínas indicadoras, como PLC-PH, aunque se usa ampliamente como sonda PIP2, además no informa de manera inequívoca los cambios en el nivel de PIP2 porque se ha demostrado que PLC-PH se desplaza de PIP2 por el aumento del producto de degradación intracelular de PIP2. IP36,46. Esta limitación es grave, ya que la vida media de PIP2 en las células es de solo 1 min47,48. La expresión de PLC-PH además afecta la fisiología celular y la señalización al competir con la enzima PLC degradante de PIP2 y apagando las señales de PIP249,50, ya que PLC-PH unido a PIP2 competirá con la unión de las proteínas efectoras de PIP2, como proteínas endocíticas, citoesqueléticas y componentes de señalización7 y, por lo tanto, dificultan el reconocimiento y la transmisión adecuados de las señales PIP2. Es importante destacar que también los procedimientos de fijación química son propensos a interferir con la distribución fisiológica de las señales de los lípidos50,51. La combinación de crioconservación muy rápida, fractura por congelación, componentes de membrana estabilizados irreversiblemente por evaporación de carbono y platino, marcaje con inmunooro de la réplica de membrana y examen TEM supera todas estas limitaciones anteriores y proporciona una visión clara de las señales PIP2 durante LTD.

Nuestras evaluaciones cuantitativas de los niveles relativos, la distribución y la organización de PIP2 y los diferentes estudios de inhibidores revelan que la señalización de PIP2 durante LTD se produce en un patrón definido. En primer lugar, se observó un rápido aumento de los niveles de PIP2 en los primeros 2 min de la inducción de LTD mediante la aplicación de NMDA. En las áreas de las membranas de las cabezas de las espinas, este primer aumento alcanzó casi el 250 % de los niveles de estado estacionario de PIP2. Un papel de PIP2 en la inducción de LTD está en línea con el hallazgo de que la dimerización inducida químicamente para trasladar la enzima inositol polifosfato 5-fosfatasa que degrada PIP2 a la membrana plasmática y, por lo tanto, agotar PIP2 en la membrana plasmática condujo a una interrupción de la inducción de LTD por estimulación de baja frecuencia19. El aumento observado en PIP2 durante la inducción temprana de LTD que determinamos contrasta fuertemente con las observaciones de una caída en la concentración de PIP2 en las espinas dendríticas 1 minuto después de la estimulación con NMDA16. Sin embargo, los respectivos datos conflictivos se obtuvieron utilizando microscopía de fluorescencia y sobreexpresión de PLC-PH marcado con GFP y, por lo tanto, se vieron afectados por todas las limitaciones técnicas y científicas ya discutidas anteriormente. El fuerte aumento de los niveles de PIP2 en la membrana plasmática de las espinas dendríticas que observamos en nuestros estudios de ultra alta resolución de membranas fracturadas por congelación se localizó específicamente en las áreas de la membrana plasmática de la cabeza de la columna. Este rápido aumento de PIP2 en la cabeza de la columna está en consonancia con el papel de PIP2 en la inducción de LTD, ya que se cree que la LTD implica principalmente reorganizaciones del citoesqueleto de actina y receptor en las cabezas de la columna1,2,3,4.

Sorprendentemente, los minutos iniciales de las señales de PIP2 durante LTD también fueron el único momento con una agrupación estadísticamente significativa de PIP2. Se han observado grupos de PIP2 en la endocitosis mediada por clatrina32. PIP2 se une a varias proteínas implicadas en la endocitosis y es esencial para iniciar y mantener el ensamblaje de fosas recubiertas de endocito52,53,54,55,56,57,58,59. El agrupamiento de PIP2 en los sitios endocíticos nacientes puede reclutar y aumentar la concentración local de proteínas, como epsina y proteínas que contienen el dominio BAR, que a su vez contribuyen a la deformación de la membrana y la formación de vesículas endocíticas60,61.

La inducción de LTD mediada por NMDA está marcada por la endocitosis del receptor AMPA en los primeros minutos después de la estimulación31,62,63 y se cree que esta internalización ocurre preferentemente en áreas perisinápticas63. Estas observaciones están en línea tanto con el marco de tiempo de las señales de PIP2 en las espinas dendríticas que determinamos como con la acumulación y perseverancia de niveles de PIP2 fuertemente elevados específicamente en las áreas superior y media de la membrana plasmática de las cabezas de las espinas dendríticas después de la inducción de LTD observada en nuestro más análisis detallados de los subdominios de la membrana de la columna vertebral.

Nuestros estudios de inhibidores indicaron que el rápido aumento de PIP2 durante la inducción inicial de LTD se genera casi exclusivamente a partir de PI4P. De acuerdo con esto, se cree que PIP5Kγ es el principal responsable de la síntesis de PIP2 en las sinapsis64. Curiosamente, la PIP5Kγ661 desfosforilada se asocia con el complejo adaptador endocitario AP265,66 y las neuronas que expresan un mutante PIP5Kγ661 muerto en quinasa o un mutante incapaz de asociarse con el complejo AP2 no exhibieron LTD después de LFS20.

La segunda fase de las señales de PIP2 en las espinas dendríticas durante la inducción de LTD estuvo marcada por un aumento adicional pero menos rápido de los niveles de PIP2, que se limitó específicamente a las áreas superior y media de la membrana plasmática de la cabeza de la columna. Nuevamente, la inhibición de PIP5K por parte de UNC3230 anuló este período de tiempo de la dinámica de PIP2. Además, la generación de PIP2 a partir de PIP3 contribuyó a los niveles elevados de PIP2 de esta fase, como lo demuestra la inhibición de PTEN usando bpV (HOpic). Este hallazgo está en línea con las observaciones de que PTEN se acumuló en el PSD después de la incubación con NMDA y la inhibición de PTEN por bpV (HOpic) abolió LTD en las neuronas del hipocampo17. Por el contrario, la primera fase de la dinámica de PIP2 fue insensible a la inhibición de PTEN. Estos resultados destacan claramente la naturaleza bifásica del aumento de los niveles de PIP2 observados en las cabezas de las espinas dendríticas durante la inducción de LTD.

Los eventos de señalización temporal requieren una terminación oportuna. Este es el aspecto principal de la tercera fase de la dinámica de PIP2 que comienza aproximadamente 10 minutos después de la inducción de LTD inducida por NMDA. Los niveles de PIP2 en estado estacionario en las espinas dendríticas se observaron después de aproximadamente 30 min. Es importante tener en cuenta que, en contraste con el uso de PLC-PH sobreexpresado como sonda PIP2, la detección directa basada en anticuerpos de PIP2 que aplicamos para nuestros análisis no se ve afectada por la disociación de PIP2 debido al aumento de IP3. La disminución observada en la densidad de marcaje refleja verdaderamente una disminución de PIP2 en la membrana plasmática de las espinas dendríticas. Si bien las tendencias de niveles ligeramente elevados de PIP2 en las áreas de la membrana plasmática de la base de la columna vertebral y la dendrita circundante pueden sugerir alguna contribución de la difusión de PIP2 fuera de las áreas de la membrana de la cabeza de la columna enriquecidas con PIP2, la disminución observada fue claramente provocada por una degradación activa de Señales PIP2 por PLC, como lo demuestra la inhibición de PLC con U-73122. De acuerdo con cierta importancia de PLC en LTD, se describió que la aplicación de U-73122 perjudica a LTD67.

Parece concebible que la reducción observada en los niveles de PIP2 en etapas posteriores esté relacionada con cambios en el citoesqueleto de actina, que finalmente conducen a la reducción de las cabezas de las espinas dendríticas observadas en LTD. PIP2 puede oponerse a las reorganizaciones de actina requeridas y estabilizar los filamentos de actina porque, por ejemplo, inhibe la actividad de corte de actina F de cofilina68 y gelsolina69. Además, PIP2 puede oponerse a la contracción de la columna uniendo el citoesqueleto de actina a la membrana plasmática70,71,72,73. Nuestra observación de que los niveles de PIP2 elevados transitoriamente alcanzaron niveles de estado estacionario en las membranas de la cabeza de la columna dendrítica 30 minutos después de la inducción de LTD está temporalmente muy en línea con la observación de que, después de estimulaciones de baja frecuencia de cortes del hipocampo, las reducciones en el volumen y el diámetro de la cabeza de la columna podrían observarse 15-60 min después de la estimulación74.

En conjunto, este estudio proporciona vistas de ultra alta resolución de PIP2 durante la inducción de LTD y revela los principios espaciales y temporales y los mecanismos moleculares que subyacen a las señales de PIP2 y su terminación oportuna durante la inducción de LTD en subdominios de la membrana de la columna dendrítica.

Los liposomas se prepararon esencialmente según Reeves y Dowben75. En detalle, las mezclas de lípidos en cloroformo y metanol (98:2 (v/v)) se esparcieron finamente en el fondo de un matraz Fernbach. Las mezclas consistieron en 65 % (p/v) de fosfatidiletanolamina (PE), 30 % (p/v) de fosfatidilcolina (PC) y 5 % (p/v) de PIP2, PIP3, PI(3,4)P2 y PS, respectivamente. . Los lípidos se secaron bajo un flujo constante de gas nitrógeno durante 30 a 60 min y los solventes restantes se eliminaron mediante una incubación de 1 h en un desecador. A continuación, los lípidos se rehidrataron con un flujo de nitrógeno saturado con agua durante 30 a 60 minutos antes de agregar 5 ml de sacarosa 0,3 M en ddH2O para permitir una mayor hidratación y separación de los liposomas del matraz durante 14 horas a 37 °C. A continuación, la suspensión que contenía los liposomas se centrifugó a 200 000 × g durante 1 hora a 28 °C. El sedimento que contenía los liposomas se resuspendió en 20 µl de sacarosa 0,3 M en ddH2O con una concentración final de lípidos de 8 mg/ml.

Las ratas (Crl:WI; Charles River) utilizadas para obtener material biológico fueron criadas por el centro de animales del Hospital Universitario de Jena en estricto cumplimiento de las directrices de la UE para experimentos con animales (aprobadas por Thüringer Landesamt, Bad Langensalza; Alemania). Dado que las células primarias se prepararon exclusivamente a partir de ratas preñadas post mortem, no se requirió permiso para experimentos con animales para este estudio. Los embriones utilizados para las preparaciones de neuronas hipocampales primarias fueron E18 y de sexo mixto (indeterminado).

Las células NIH3T3 se mantuvieron y cultivaron en condiciones estándar.

Las neuronas primarias del hipocampo de rata (Crl:WI; Charles River) se prepararon y cultivaron en gran parte de acuerdo con los principios desarrollados por Banker y Cowan76 y establecidos previamente23. En detalle, se diseccionaron cerebros de ratas E18 en HBSS enfriado con hielo (Invitrogen). A continuación, los hipocampos aislados se tripsinizaron con tripsina/EDTA al 0,05 % (Invitrogen) durante 15 min a 37 °C. El sobrenadante se cambió por medio Neurobasal (Invitrogen) y se complementó con suplemento B-27 (Invitrogen) y L-glutamato 0,5 mM. A continuación, el tejido se disoció en células individuales mediante trituración cuidadosa con una pipeta Pasteur de 1 ml.

Como preparación para la fractura por congelación, las neuronas debían cultivarse en placas de 24 pocillos con discos de zafiro (Rudolf Brügger, Swiss Micro Technology)22,23. Como preparación, los discos de zafiro se limpiaron y lavaron cuidadosamente y luego se recubrieron con poli-D-lisina durante la noche a 37 °C. La poli-D-lisina se aspiró y se eliminó cuidadosamente lavando tres veces durante 10 min con ddH2O. A continuación, los discos de zafiro se secaron y se irradiaron con luz ultravioleta durante 15 min.

Las neuronas primarias se sembraron a una densidad de 80.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos complementada con los discos de zafiro preparados. A continuación, las neuronas primarias del hipocampo se cultivaron en medio NeurobasalTM que contenía L-glutamina 2 mM, 1x B27 y penicilina/estreptomicina (100 U y 100 µg, respectivamente, por ml) durante aproximadamente 2 semanas (a 37 °C, 90 % de humedad). y 5% CO2). En DIV14-16 en zafiro, las neuronas habían formado sinapsis y redes neuronales22 y luego se usaron para los experimentos.

Se indujo LTD con NMDA26,31. En detalle, las neuronas del hipocampo se silenciaron presinápticamente mediante una preincubación con TTX 2 µM (60 min) antes de inducir LTD con NMDA 50 µM durante hasta 3 min seguido de persecución en medio preacondicionado para distintos puntos de análisis.

Para investigar las vías que proporcionan transitoriamente PIP2 durante la inducción de LTD y que conducen a una disminución de los niveles de PIP2 en puntos de tiempo posteriores, se agregaron inhibidores o su control de solvente correspondiente antes del tratamiento con NMDA. Las concentraciones finales y los tiempos de preincubación fueron los siguientes: bpV (HOpic), 15 nM en ddH2O durante 60 min; U-73122, 10 µM durante 60 min en DMSO al 0,2 % (v/v); UNC3230 a 500 nM durante 16 h en DMSO al 0,002 % (v/v).

Se utilizaron perfiles de cobre (0,6 mm de altura) para la fracturación por congelación. Previo a su uso, los perfiles se limpiaron en un baño de ultrasonidos con ácido tartárico al 4% (p/v), se lavaron en acetona pura y luego se almacenaron en metanol puro.

Para la criofracturación de liposomas, se distribuyeron 2 µl de la solución de liposomas entre dos perfiles de cobre utilizando la técnica de doble réplica en sándwich77. El sándwich se congeló inmediatamente por inmersión en propano líquido/etano (1:1) enfriado en nitrógeno líquido (tasa de enfriamiento >4000 K/s)78.

Se colocaron tres sándwiches en una mesa de especímenes de réplica doble también enfriada en nitrógeno líquido. Luego, las muestras se transfirieron a una máquina de fractura por congelación BAF400T (Leica) enfriada a -140 °C. Después de que se estableció el vacío y la presión no superó los 10-6 mbar, se abrió la mesa de manera que los dos perfiles emparedados con la muestra entre ellos se separaron y fracturaron por congelación la muestra. Inmediatamente, se evaporó sobre las muestras una capa de carbono de 15–20 nm en un ángulo de 90°, seguida de una capa de platino/carbono de aproximadamente 2 nm en un ángulo de 35°78. Las muestras se extrajeron de la máquina de congelación y fractura, se descongelaron, se flotaron en SDS al 2,5 % (p/v) y se incubaron con agitación suave durante la noche a temperatura ambiente.

Después de tres lavados de 10 min en PBS, se bloqueó cualquier unión inespecífica mediante incubación en BSA al 1 % (p/v), gelatina de pescado al 0,5 % (p/v), Tween® 20 al 0,005 % (v/v) en PBS (pH 7.2) (LBB) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, las réplicas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos monoclonales de ratón anti-PIP2 (Enzo Life Sciences) en LBB (condición estándar, 1:100, es decir, 10 µg/ml). El anticuerpo primario no unido se eliminó lavando tres veces con LBB (10 min cada vez). A continuación, las muestras se incubaron durante 2 h en anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra unidos a partículas de oro diluidos en LBB (a temperatura ambiente) (5, 10 y 15 nm de oro; soluciones BBI). El anticuerpo secundario no unido se eliminó mediante lavado (3 × 10 min) con PBS. A continuación, las réplicas inmunomarcadas se fijaron con glutaraldehído al 0,5 % (v/v) en PBS durante 10 min, se lavaron dos veces durante 10 min con ddH2O, se montaron en rejillas de cobre sin recubrimiento y se secaron.

Para la fractura por congelación de células NIH3T377,78, se colocó una suspensión de las células entre dos perfiles de cobre similares a los descritos anteriormente para análisis de liposomas y luego se fracturaron por congelación y se inmunomarcaron como se describe anteriormente.

Para los experimentos de fractura por congelación neuronal 22,23,24, las neuronas se cultivaron en discos de zafiro recubiertos con poli-D-lisina (ver arriba). Los discos de zafiro se colocaron en perfiles de cobre de 0,8 mm de altura para encajar en la mesa de especímenes de doble réplica. Se añadió una gota de BSA al 20 % (p/v) entre las partes del sándwich para evitar la congelación de artefactos. A continuación, se llevó a cabo la fractura por congelación y el inmunomarcaje como se ha descrito anteriormente.

Las réplicas se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión EM902A (Zeiss) operado a 80 keV.

La formación de imágenes se realizó utilizando una cámara CCD FastScan de 1 k (cámara TVIPS y software). Las imágenes se digitalizaron con el software EM-Menu 4 (TVIPS)22,23,24.

La detectabilidad de PIP2 en membranas por anticuerpos anti-PIP2 se abordó primero utilizando liposomas que contenían PIP2. Se examinaron como controles los liposomas que contenían PIP3, PI(3,4)P2 y PS, respectivamente, en lugar de PIP2. Las imágenes se tomaron mediante muestreo aleatorio, es decir, independientemente del etiquetado de PIP2 e incluyendo perfiles cero. Lo mismo se aplica a la formación de imágenes de las membranas celulares NIH3T3.

Se realizaron determinaciones de especificidad de inmunomarcaje anti-PIP2 con membranas de neuronas fracturadas por congelación con neuronas de hipocampo de rata en DIV14-16 y muestreo sistemático a través de las rejillas. Se midieron las áreas de las tres categorías (hielo y cara E como controles frente a cara P), se contó la cantidad de partículas de oro por área y se compararon las densidades de marcado (determinadas como partículas por µm2) para probar la especificidad del anticuerpo.

Los controles de anticuerpos secundarios y las muestras fracturadas por congelación, para las cuales la unión del anticuerpo primario se detuvo mediante la preincubación del anticuerpo con liposomas con PIP2 añadida, sirvieron como controles adicionales.

Se utilizaron experimentos cuantitativos adicionales con diferentes diluciones de anticuerpos anti-PIP2 (1:200, 1:100, 1:50 correspondientes a concentraciones de 5, 10 y 20 µg/ml) para establecer una dilución de anticuerpos que produzca una detección de PIP2 saturada.

Antes de la visualización por TEM, un colega cegó las muestras. El cegamiento de las imágenes grabadas se realizó utilizando el software Ant Renamer (antp.be/software/renamer). Las imágenes TEM se obtuvieron mediante la detección sistemática de las cuadrículas.

Las imágenes de las áreas de la membrana plasmática fracturada por congelación del soma celular y del árbol dendrítico se registraron mediante un registro sistemático, se cegaron las imágenes (ver arriba), se determinaron las áreas respectivas (cara E, cara P, hielo) y el anti -Se determinó la densidad de marcaje de PIP2. Se utilizaron para el análisis todas las estructuras morfológicas que claramente podían clasificarse como espinas de hongos, así como los segmentos dendríticos vecinos no decorados con espinas, es decir, solo imágenes con espinas dendríticas de menos de 0,75 µm y más de 2 µm de longitud e imágenes de espinas sin espinas. se descartó cualquier unión dendrítica visible.

Las espinas se subdividieron en base, cuello y cabeza de la columna. Para algunos análisis, la cabeza de la columna vertebral se dividió aún más en tres partes al dividir la longitud de la cabeza en tres partes de igual altura, lo que resultó en una cabeza superior, media e inferior. El procedimiento para las definiciones de área fue el siguiente: Primero se definió la base. Se dibujó una línea de tierra que interconectaba los puntos de la membrana dendrítica adyacentes a la columna vertebral. Se dibujaron otras dos líneas paralelas de igual longitud que flanqueaban la línea de tierra a distancias de 150 nm y luego se conectaron (ángulos de 90°). Las áreas celulares incluidas se definieron como área base (ver también Fig. 2). Desde una posición que representaba la mitad de la línea del suelo, se dibujó otra línea hasta la punta del lomo para definir su eje longitudinal. Rectangular desde el eje longitudinal de la columna, se trazó una línea en un ángulo de 90° para separar el cuello de la región de la cabeza (Fig. 2). Este borde generalmente era fácilmente reconocible por el ensanchamiento 2D del cuello y por la información 3D proporcionada por el sombreado de platino (Fig. 2). El área de la cabeza se dividió aún más en tres áreas (cabeza inferior, cabeza media y cabeza superior) mediante dos líneas rectangulares al eje longitudinal dibujadas en posiciones que reflejan un tercio y dos tercios de la longitud de la cabeza definida por el eje longitudinal (Fig. 4a) . Luego, todas las áreas se rodearon con la herramienta de selección de polígonos en ImageJ/FIJI siguiendo las líneas de borde predefinidas y el perfil de la membrana, respectivamente, y se midieron con ImageJ.

Se contaron las marcas de inmunooro anti-PIP2 dentro de cada área y se determinó la densidad de marcaje para cada subdivisión y para un área de membrana dendrítica adicional correspondiente a la columna vertebral analizada utilizando ImageJ/FIJI. En caso de que las etiquetas se colocaran directamente en el borde dibujado o en las líneas de separación, se asignaron al área cubierta por la partícula de oro en una extensión mayor. Se consideraron todos los datos obtenidos, incluidos valores altos y perfiles cero. No se realizaron análisis de "valores atípicos" y no se eliminaron "valores atípicos" de las recopilaciones de datos, ya que la variación biológica se refleja en la gama completa de densidades de etiquetado determinadas.

Para los análisis de resolución temporal de las señales de PIP2 en las columnas vertebrales y los estudios de inhibidores, todos los resultados se normalizaron a la densidad de etiquetado promedio detectada en la columna vertebral general de la condición de estado estacionario (0 min).

Los análisis de conglomerados se realizaron utilizando ROI circulares de un diámetro de 100 nm. De acuerdo con los procedimientos establecidos previamente22,23,24,77, los clústeres se definieron como n ≥ 3 partículas de oro por ROI.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism. Si, utilizando la prueba de Shapiro-Wilk, los datos se distribuyeron normalmente, una prueba t de Student (comparaciones de dos condiciones) o un análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía) con una prueba de comparaciones múltiples de Tukey posterior ( comparación de más de dos condiciones).

Si la prueba de Shapiro-Wilk sugería una distribución no normal, se empleaba una prueba de Mann-Whitney (para 2 condiciones) o una prueba de Kruskal-Wallis (≥3 condiciones) con una prueba de comparación múltiple de Dunn posterior.

Para los análisis de dos factores, se realizó ANOVA de dos vías en combinación con las pruebas de comparación múltiple posteriores de Šídák o Bonferroni.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y sus archivos de información complementaria. Para conocer los datos de origen que informan todos los puntos de datos individuales subyacentes a los análisis cuantitativos, consulte Datos complementarios 1.

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Koch, D., Westermann, M., Kessels, MM y Qualmann, B. El inmunomarcaje de fractura por congelación ultraestructural identifica la sindapina II localizada en la membrana plasmática como un factor crucial en la formación de caveolas. Histoquimica. Biol celular. 138, 215–230 (2012).

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Damos las gracias a K. Gluth, A. Kreusch, S. Linde y M. Roeder por el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la IZKF y por la DFG (RTG1715 SP19 y KE685/7-1 a MMK y QU116/9-1 a BQ).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Bioquímica I, Hospital Universitario de Jena — Universidad Friedrich Schiller Jena, 07743, Jena, Alemania

Sarah A. Hofbrucker-MacKenzie, Eric Seemann, Britta Qualmann y Michael M. Kessels

Centro de Microscopía Electrónica, Hospital Universitario de Jena — Universidad Friedrich Schiller de Jena, 07743, Jena, Alemania

Martín Westermann

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SAH-M. y ES diseñó y realizó experimentos e interpretó los datos. SAH-M. coescribió partes del manuscrito. MW brindó asesoramiento técnico y acceso a técnicas y equipos de microscopía electrónica. Datos visualizados de SAH-M., ES y MMK. MMK realizó los exámenes independientes de confirmación exigidos. BQ y MMK concibieron el proyecto, diseñaron experimentos, interpretaron los datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Britta Qualmann o Michael M. Kessels.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Zachary T. Graber y Yugo Fukazawa por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de Manejo Principal: Joao Valente. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Hofbrucker-MacKenzie, SA, Seemann, E., Westermann, M. et al. La depresión a largo plazo en las neuronas implica dinámicas temporales y ultraestructurales de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato que se basan en PIP5K, PTEN y PLC. Comun Biol 6, 366 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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Recibido: 21 junio 2022

Aceptado: 17 de marzo de 2023

Publicado: 03 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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