Nuevos enfoques para el desarrollo de biomarcadores del uso de anticonceptivos hormonales

Jul 22, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 245 (2023) Citar este artículo

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Para identificar los biomarcadores del uso de anticonceptivos hormonales (HC) en la orina y la saliva, llevamos a cabo un estudio piloto con 30 mujeres que iniciaban el tratamiento con levonorgestrel (LNG) que contenían anticonceptivos orales combinados (AOC) o acetato de medroxiprogesterona de depósito (DMPA) (15/grupo). Con base en la farmacocinética establecida de COC, recolectamos muestras de suero y orina antes de la ingestión de COC y durante los días uno y tres de uso, o antes de la inyección de DMPA y los días 21 y 60 después de la inyección. Utilizamos cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para medir LNG y MPA en suero/orina. LNG fue indetectable al inicio (especificidad 100%); después de la ingestión, la mayoría de las muestras de orina tenían niveles detectables de LNG (sensibilidad: 80 % 6 h después de la dosis uno, 93 % 6 h después de la dosis tres). Utilizamos un kit de inmunoensayo DetectX LNG y mostramos una sensibilidad del 100 % en la medición de LNG en orina. Los niveles de MPA en orina fueron indetectables en 14/15 mujeres al inicio (especificidad 91%); después de la inyección, todas las muestras de orina tenían niveles detectables de MPA (sensibilidad: 100 % los días 21 y 60). Los resultados sugieren que el muestreo de orina se puede utilizar para identificar un biomarcador del uso de LNG y MPA. Con base en la evidencia de otros estudios de hormonas esteroides que muestran cambios que afectan el perfil del transcriptoma de la saliva a las 24 h, usamos los mismos puntos de tiempo (AOC, DMPA) para recolectar saliva. Realizamos un análisis del transcriptoma y detectamos varios genes expresados ​​diferencialmente en la saliva de los usuarios de DMPA en los días 21 y 60 en comparación con la línea de base; ninguno entre los usuarios de AOC. Planificamos más investigaciones sobre la expresión génica diferencial en la saliva como biomarcador de HC del uso de DMPA, y exploraremos períodos más prolongados de uso de AOC y tiempos de recolección de saliva, y la aplicación de secuenciación de microARN para apoyar el uso de la saliva como biomarcador de AOC.

Los datos precisos sobre el uso de anticonceptivos tienen implicaciones para establecer objetivos de salud pública, brindar atención clínica y realizar investigaciones clínicas. En el campo de la salud pública, las estadísticas sobre las tasas de prevalencia anticonceptiva (IPC) afectan la planificación para lograr objetivos nacionales e internacionales realistas para los servicios de salud sexual y reproductiva1,2,3. La precisión de los datos de CPR es especialmente importante en las regiones donde las tasas de embarazo siguen siendo altas a pesar de los informes de altas tasas de uso de anticonceptivos. Como resultado, la provisión de servicios de atención clínica obstétrica y neonatal puede no ser proporcional a las necesidades locales, regionales o nacionales4,5,6. El acceso a la información sobre el uso de anticonceptivos también puede facilitar la toma de decisiones compartida entre médicos y clientes con respecto a la selección del método anticonceptivo más adecuado para lograr las metas individuales de planificación familiar7. En cuanto a los ensayos clínicos, los datos obtenidos de los voluntarios sobre el uso de un método constituyen la base para analizar y reportar los resultados de seguridad, eficacia y aceptabilidad y son fundamentales para las revisiones regulatorias y las decisiones sobre la aprobación de nuevos métodos8.

Dada la importancia general de la información sobre el uso de anticonceptivos, numerosos investigadores han reflexionado sobre los desafíos actuales asociados con la obtención de datos precisos basados ​​en autoinformes7,8,9,10,11,12,13. Recientemente, varios investigadores han descrito resultados más alentadores en la obtención de datos precisos, pero recomiendan el uso de medidas objetivas para validar el uso de anticonceptivos autoinformado14,15. La medición de los niveles de concentración sérica de progestágenos sintéticos (el componente activo de los anticonceptivos hormonales) en las muestras se considera el "estándar de oro"16 para evaluar el uso de anticonceptivos hormonales (HC). Sin embargo, tales pruebas requieren venopunciones invasivas, dependen de laboratorios con capacidad específica para evaluar las concentraciones de hormonas exógenas y no son prácticas para su uso en encuestas domiciliarias o ensayos clínicos de última etapa con miles de participantes. Se están desarrollando enfoques de investigación para medir los niveles de hormonas en la orina, aunque tienden a basarse en el muestreo de progesterona y estrógeno endógenos (como el estradiol) en el contexto de la atención clínica17. Como se ha descrito bien, tanto las hormonas esteroides endógenas como las sintéticas se metabolizan principalmente en el hígado y se excretan parcialmente como metabolitos conjugados y hormonas intactas en la orina. Anticipamos que podríamos usar métodos bien descritos y altamente sensibles para medir estas hormonas o sus metabolitos en muestras de orina como marcadores del uso hormonal17,18,19,20. Específicamente, especulamos que podríamos usar métodos validados de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS) para medir los niveles de LNG y MPA en muestras de sangre y orina, así como el kit de inmunoensayo enzimático de LNG altamente sensible (DetectX; Arbor Assays, MI, EE. UU.) para medir LNG inmunorreactivo en orina. Por lo tanto, buscamos determinar si la orina, que se puede recolectar de manera más fácil y rentable que el suero, podría usarse como un biomarcador objetivo de los anticonceptivos de uso común formulados con progestágenos, como el levonorgestrel (LNG), que se encuentra en muchos anticonceptivos orales combinados. (AOC) o acetato de medroxiprogesterona (MPA) utilizado en formulaciones inyectables, por ejemplo, acetato de medroxiprogesterona de depósito (DMPA).

También consideramos el potencial de usar saliva para identificar biomarcadores, ya que este fluido corporal no es simplemente un ultrafiltrado de plasma, sino que también contiene una biblioteca completa de proteínas, hormonas, anticuerpos y otros compuestos moleculares. Es una matriz ideal para la aplicación de la transcriptómica para analizar la expresión génica diferencial21. Teorizamos que las hormonas esteroides sintéticas como LNG y MPA ingresan a la saliva a través de la difusión pasiva. Sin embargo, sus concentraciones esperadas son bajas en comparación con la sangre y no se pueden medir de manera confiable utilizando métodos como ELISA que comúnmente se aplican para muestras de suero y orina. También consideramos que con el uso de anticonceptivos hormonales, el perfil del transcriptoma cambiaría en la saliva y que tales cambios podrían servir como un biomarcador potencial de exposición a anticonceptivos. Especulamos que podríamos usar la secuenciación de ARN para identificar genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en muestras de saliva obtenidas de personas que usan anticonceptivos hormonales22,23,24,25.

En consecuencia, llevamos a cabo un estudio piloto transversal, de etiqueta abierta, para determinar si podíamos usar pruebas validadas para medir las hormonas o sus metabolitos en muestras de orina obtenidas de personas que usaban AOC o DMPA. También exploramos la viabilidad de usar secuenciación de ARN con muestras de saliva para detectar genes expresados ​​diferencialmente como marcador del uso de anticonceptivos hormonales.

El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Consejo de Población, el Comité de Ética de Profamilia (sitio del estudio) en la República Dominicana y CONABIOS, la agencia nacional de investigación médica de la República Dominicana. Cada participante proporcionó su consentimiento informado por escrito antes de someterse a cualquier procedimiento de selección. El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki, la Conferencia Internacional sobre Armonización de las Pautas de Buenas Prácticas Clínicas y el Código de Regulaciones Federales de EE. UU. relacionadas con los estudios clínicos.

Reclutamos mujeres interesadas en comenzar con DMPA o AOC durante la duración del estudio e inscribimos dos grupos (15 por grupo). Los individuos del Grupo A usaron un AOC que contenía etinilestradiol y LNG (EE: 30 mcg y LNG 150 mcg Microgynon-Bayer, Alemania) y los del Grupo B usaron DMPA 150 mg (Pfizer Manufacturing Belgium NV, Bélgica) administrados por vía intramuscular. Los adultos sanos, no embarazadas, que no amamantaban (18 a 39 años) que actualmente no usaban DMPA y que podían proporcionar un consentimiento informado por escrito fueron elegibles. Excluimos a las participantes potenciales si estaban inscritas en cualquier otro estudio que involucrara productos anticonceptivos actualmente o en los 2 meses anteriores a la selección, tenían contraindicaciones para el uso de los anticonceptivos seleccionados, experimentaban sangrado vaginal (sin incluir manchado entre períodos), dieron positivo para Infección por VIH o hepatitis B en la selección, o haber usado DMPA en los últimos 12 meses. En la Tabla complementaria 1S se presenta una lista completa de los criterios de inclusión/exclusión.

Todos los participantes tuvieron tres visitas después de la selección; el período de tiempo para recolectar muestras de suero, orina y saliva varió según el grupo/método anticonceptivo (Tabla 1). Los participantes del Grupo A tomaron su primera, segunda y tercera píldora en el sitio de estudio. Se les recolectó suero, orina y saliva antes de recibir su primera dosis y en intervalos designados los Días 1 y 3. A los participantes del Grupo B se les tomaron muestras de suero, orina y saliva antes de recibir su primera inyección de DMPA el Día 1, y nuevamente en los Días 21 y 60 (± 4 días). El personal del sitio supervisó a los participantes para detectar la aparición de eventos adversos (AE) y eventos adversos graves (SAE) durante todo el estudio. Los datos de los participantes se anonimizaron en todos los documentos del estudio, muestras, análisis y cálculos posteriores.

Seleccionamos puntos de tiempo para recolectar muestras de orina y suero de usuarias de AOC en función de la farmacocinética (PK) establecida de los AOC que implican concentraciones máximas y mínimas diarias de progestina y son las mismas para cada período de 24 horas durante los días del ciclo en que se administra la píldora. tomado para suprimir la ovulación26. La concentración sérica máxima de LNG administrado por vía oral es generalmente alrededor de una a dos horas después de la ingestión, y sus metabolitos junto con pequeñas cantidades de LNG no metabolizado aparecen en la orina aproximadamente de cuatro a ocho horas después de la ingestión. Por lo tanto, seleccionamos un punto de tiempo de seis horas para recolectar suero y orina luego de la ingestión de AOC y seleccionamos los Días 1 y 3 para recolectar muestras (Tabla 1).

También usamos datos farmacocinéticos establecidos para seleccionar puntos temporales de recolección de suero y orina para usuarios de DMPA27. El MPA se libera lentamente desde el sitio de inyección del DMPA hacia la sangre y los niveles se mantienen para lograr la supresión de la ovulación (eficacia) durante al menos tres meses. Pequeñas cantidades de MPA no metabolizado y sus metabolitos aparecen en la orina en un estado estacionario a partir del día 3 posterior a la inyección y pueden medirse de forma fiable durante todo el período prolongado de tratamiento. La concentración máxima de MPA generalmente se encuentra en el suero alrededor de tres semanas después de la inyección y los niveles se mantienen para lograr la eficacia durante al menos tres meses. Por lo tanto, recolectamos suero de usuarios de DMPA el día 21 y seleccionamos el día 60 para la segunda recolección (Tabla 1).

Con respecto a la saliva, el objetivo fue identificar el impacto en el perfil del transcriptoma de la saliva en respuesta al uso y concentración de LNG y MPA en suero. Dado que la saliva es un buen indicador de los niveles plasmáticos de diversas sustancias, como hormonas y productos farmacéuticos, y el ARNm salival sirve como firma química de que se ha expresado un gen en particular21, asumimos que podríamos usar los mismos puntos de tiempo que seleccionamos para la recolección de suero. y orina para recolectar saliva (Tabla 1). Al seleccionar estos mismos puntos de tiempo, también nos influyeron los hallazgos de estudios que examinaron otras hormonas esteroides. Con la testosterona, por ejemplo, los investigadores identificaron un aumento significativo en los niveles de testosterona en la saliva, la sangre y la orina cuando se administra por vía transdérmica28.

Suero Un flebotomista recolectó 10 ml de sangre por participante que se procesó para obtener suero, se congeló inmediatamente y se almacenó a -20 °C hasta que se envió en hielo seco al Consejo de Población de Nueva York para su análisis.

Orina Proporcionamos a los participantes recipientes de muestreo para recolectar 20-30 ml de orina en puntos de tiempo específicos. Estos se mantuvieron a – 20 °C hasta su envío.

El personal del sitio de saliva instruyó a los participantes para que se abstuvieran de comer, beber, fumar o realizar procedimientos de higiene oral durante al menos una hora antes de la toma de muestras y de escupir saliva en un tubo de ensayo graduado en el transcurso de 5 minutos para recolectar aproximadamente 5 ml de saliva. Para inhibir la degradación del ARN, el personal del sitio mantuvo los tubos de recolección en hielo antes de recolectar la saliva. De acuerdo con las instrucciones del proveedor (Norgen Biotek, CA, EE. UU.), el personal del sitio agregó 2 ml de conservante que contenía un reactivo estabilizador inmediatamente después de la recolección y almacenó los tubos de recolección a -80 °C en preparación para el envío.

Antes de medir los niveles hormonales en las muestras del estudio, utilizamos nuestro protocolo estándar de acuerdo con las pautas de la FDA para validar nuestros métodos LCMS para medir LNG y MPA en suero y orina. Específicamente, agregamos seis niveles de concentración de estándares de calibración (STD) en el rango entre 0,1 y 10 ng/mL en suero humano y preparamos por separado tres niveles de muestras de control de calidad (QC) a concentraciones de 0,3, 1 y 7 ng/mL. Utilizamos LNG-d6 o MPA-d6 (5 ng/ml) como estándares internos (IS) respectivamente y evaluamos y validamos los siguientes parámetros: especificidad, linealidad, límite de cuantificación, exactitud, precisión, efectos de matriz, recuperación y estabilidad. . Nuestros resultados mostraron que cumplimos con los criterios de aceptación de todos los parámetros de validación según el protocolo.

Para el siguiente paso, medimos los niveles de LNG y MPA en muestras de suero y orina mediante LC-MS/MS utilizando LNG-d6 o MPA-d6 como estándares internos, respectivamente. Para purificar LNG o MPA de muestras de prueba de suero, utilizamos el método de precipitación de proteínas. Específicamente, agregamos 100 µl de metanol a 100 µl de la muestra de prueba que contenía el IS (5 ng/ml). Agitamos las muestras durante 15 minutos (centrifugadas a 14,5 × 103 rpm durante 10 minutos) y transferimos los sobrenadantes a viales de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para inyección. Además, procesamos los estándares de LNG o MPA y las muestras de control de calidad que se enriquecieron con IS utilizando el mismo método de precipitación de proteínas.

Para purificar LNG o MPA de muestras de orina, realizamos una extracción en fase sólida utilizando cartuchos Oasis HLB Plus Light (Waters Corporation, Milford, MA). Eluimos LNG o MPA del cartucho usando 1 ml de metanol y secamos cada muestra bajo gas nitrógeno. Reconstituimos el LNG/MPA purificado con 150 µl de fase móvil A/B (50/50, v/v) e inyectamos alícuotas de 10 µl en el ensamblaje del autoinyector. Además, procesamos estándares de LNG o MPA, muestras de control de calidad enriquecidas con IS y 1 ml de orina humana en blanco utilizando el mismo método de extracción en fase sólida. Utilizamos la columna Waters Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 2,1 × 50 mm) para separar LNG o MPA de otros componentes mediante elución en gradiente usando la fase móvil de 80 % A (formato de amonio 2 mM + 0,1 % de ácido fórmico en metanol al 10 %). ) y 20 % B (100 % metanol) hasta 6 minutos hasta 90 % B con un caudal de 0,3 ml/min. Luego usamos TQ-s de Waters para monitorear las transiciones de iones producto de 313,35 m/z a 245,28 m/z para GNL y de 319,38 a 251,32 m/z para LNG-d6 IS. De manera similar, monitoreamos las transiciones de 387,42 m/z a 327,35 m/z para MPA y de 393,40 m/z a 330,34 m/z para MPA-d6 IS. Utilizamos el software MassLynx versión 4.2 para controlar todos los parámetros del sistema LC-MS/MS.

Al analizar las muestras del estudio, incluimos seis niveles de estándares de calibración, un blanco doble, un blanco de matriz enriquecido con estándar interno y tres niveles de muestras de control de calidad (n = 2). Colocamos un conjunto de muestras de control de calidad al frente de la cola de muestras y otro conjunto al final de la cola de muestras. Los estándares de calibración se inyectaron en la parte delantera y se reinyectaron al final de la cola de muestras. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) para LNG y MPA en suero fue de 0,1 ng/ml y para LNG y MPA en orina fue de 25 pg/ml. Se usó 50 µl de la muestra de suero para LNG o MPA en el ensayo de suero y se usó 1 ml de muestra de orina humana para LNG o MPA en el ensayo de orina. El coeficiente de variación intraensayo e interensayo fue inferior al 15 % según los resultados de las muestras de control de calidad.

Utilizamos un kit comercial DetectX LNG EIA (Arbor Assays, MI, EE. UU.) para medir LNG y metabolitos en muestras de suero y orina. Para validar el ensayo, primero medimos los niveles de LNG en muestras de suero y los comparamos con los valores obtenidos por LC-MS/MS. A continuación, optimizamos la medición de los niveles de LNG en las muestras de orina que se purificaron mediante la misma extracción en fase sólida descrita para los procedimientos de medición de LC-MS/MS. Reconstituimos los residuos secos con un tampón de ensayo y utilizamos el procedimiento del kit de inmunoensayo para medir las concentraciones de LNG. Informamos los valores de LNG en orina como pg/mL; el límite inferior de detección fue de 80 pg/ml.

Para extraer el ARN total de la saliva de cada participante, usamos el tampón de lisis TRIzol® y luego purificamos ese ARN con un kit de extracción de ARN Nucleospin (Takara Bio, CA, EE. UU., Inc). Medimos las concentraciones de ARN con el fluorómetro Qubit (Life Technologies, MA, EE. UU.) y la integridad del ARN con el bioanalizador (Agilent 4200 Tape Station). Realizamos preparaciones de bibliotecas de ARN para reacciones de secuenciación. Luego etiquetamos el ARN y lo secuenciamos usando el kit Total RNA-Seq. Utilizamos el kit de entrada ultra baja SMART-Seq v4 para secuenciación para la síntesis y amplificación de ADNc de longitud completa (Clontech, CA, EE. UU.), y la biblioteca Illumina Nextera XT para la preparación de la biblioteca de secuenciación. Brevemente, se fragmentó el ADNc y se añadió el adaptador utilizando transposasa, seguido de una PCR de ciclo limitado para enriquecer y añadir un índice a los fragmentos de ADNc. La biblioteca final se evaluó con Agilent TapeStation. Las muestras se secuenciaron utilizando una configuración de extremo emparejado (PE) de 2 × 150. Usando los servicios de GENEWIZ, LLC. (South Plainfield, NJ, EE. UU.), realizamos el análisis bioinformático y aplicamos el software de control HiSeq (HCS) para realizar el análisis de imágenes y la llamada de base. Convertimos los datos de secuencia sin procesar (archivos .bcl) generados a partir de Illumina HiSeq en archivos fastq y los desmultiplexamos con el software bcl2fastq 2.17 de Illumina. Se permitió un desajuste para la identificación de la secuencia índice. Después de la demultiplexación, verificamos la calidad y el rendimiento general de los datos de secuencia. Luego, recortamos las lecturas de secuencias para eliminar posibles secuencias adaptadoras y nucleótidos de mala calidad utilizando Trimmomatic v.0.36. Asignamos las lecturas recortadas al genoma de referencia Homo sapiens GRCh38 disponible en ENSEMBL usando el alineador STAR v.2.5.2b que usa un alineador empalmado para detectar uniones de empalme e incorporarlas para ayudar a alinear las secuencias de lectura completas, lo que da como resultado archivos BAM. Luego aplicamos el paquete de software Subread v.1.5.2, que utiliza recuentos de características para calcular los recuentos de aciertos de genes únicos. Solo contamos las lecturas únicas que se encontraban dentro de las regiones del exón y usamos la tabla de recuentos de genes para analizar la expresión diferencial aguas abajo.

El criterio principal de valoración del estudio fue la sensibilidad y la especificidad de la detección de LNG o MPA en la orina. Calculamos la sensibilidad como el número total de muestras de orina con LNG o MPA detectables por LC-MS/MS dividido por el número de muestras de suero con LNG o MPA detectables por punto de tiempo. Calculamos la especificidad como el número de muestras de orina con LNG o MPA indetectables dividido por el número de muestras de suero con LNG o MPA indetectables por punto temporal. También calculamos la sensibilidad y especificidad de las mediciones de LNG en orina por EIA. Calculamos intervalos de confianza del 95 % basados ​​en pruebas exactas en torno a cada estimación de sensibilidad y especificidad.

Como criterio de valoración exploratorio, buscamos pruebas en la saliva de la expresión diferencial de genes específicos después de la ingesta de AOC o la inyección de MPA por parte de los voluntarios. Usamos DESeq2 para comparar la expresión génica al inicio (antes de la dosis) con los resultados en los intervalos posteriores a la dosis de las muestras de saliva de los usuarios de COC y MPA. Al aplicar la prueba de Wald, generamos valores p y cambios de pliegue Log2. También identificamos genes con valores de p por debajo de los valores críticos ajustados de Benjamini-Hochberg. Utilizamos estos resultados para ajustar las comparaciones múltiples y para mantener una tasa de error de tipo 1 general por debajo de < 0,05 y cambios de pliegue log2 absolutos > 1 para determinar los DEG para cada comparación. Luego generamos gráficos de volcanes utilizando los 500 genes principales, seleccionados por cambio de pliegue Log2 y valores p ajustados. Realizamos un análisis de ontología génica en el conjunto de genes estadísticamente significativo a través del software GeneSCF v.1.1-p2. Utilizamos la lista GO humana de anotación de ontología de genes (GOA) para agrupar el conjunto de genes en función de sus procesos biológicos y determinamos su importancia estadística. Generamos una lista de genes agrupados en función de sus ontologías de genes.

Entre agosto y noviembre de 2019, seleccionamos a 41 participantes potenciales e inscribimos a 30, 15 por grupo (Fig. 1). Todos los participantes eran hispanos, mestizos, con hijos y tenían una mediana de edad de 29,5 años (Tabla 2). Los 30 participantes completaron el estudio en diciembre de 2019 sin SAE o AE que condujeran a interrupciones tempranas.

Diagrama de flujo del estudio. Diagrama de consorte que muestra que se evaluaron 41 participantes potenciales y se inscribieron 30, de los cuales 15 por grupo (COC o Depo).

Sensibilidad/Especificidad de LNG en orina: En las Figs. 2A y B hemos presentado los valores cuantificados en suero y orina para los días 1 y 3, respectivamente. La Tabla 3 muestra los resultados de sensibilidad y especificidad de LC-MS/MS y EIA para las mediciones de LNG en orina de usuarias de AOC. Con ambos métodos, observamos una especificidad del 100 %, sin que ningún individuo tuviera LNG detectable en suero u orina al inicio (antes de la ingestión de AOC). Después de la ingestión de AOC, se detectó LNG en suero para todos los participantes en todos los puntos de recolección. La sensibilidad del LNG en orina por análisis de LC-MS/MS en el día 1 fue del 80 % seis horas después de la dosis 1 y en el día 3 fue del 60 % 24 horas después de la dosis 2 y del 93 % seis horas después de la dosis 3; la sensibilidad con EIA fue del 100 % en todos los puntos temporales.

(A) Las concentraciones de levonorgestrel (LNG) medidas por el método LCMS/MS en muestras de suero y orina se recolectaron los días 1 y 3 del tratamiento con AOC. Ningún individuo mostró LNG detectable en suero u orina al inicio (Pre), pero todos mostraron un aumento a las 6 h posteriores a la ingestión en ambos días (día 1 y 3). Solo ocho de 15 participantes tenían niveles detectables en los tres puntos de tiempo después de la línea de base. Seis participantes tenían niveles de LNG por debajo del nivel de cuantificación en el punto de tiempo mínimo (24 h después de la dosis 2), tres de los cuales también tenían niveles indetectables 6 h después de la primera dosis. (B) Concentraciones de levonorgestrel (LNG) medidas mediante el método de inmunoensayo enzimático (EIA) en muestras de orina recolectadas los días 1 y 3 del tratamiento con AOC. Ningún individuo mostró LNG detectable en suero u orina al inicio (Pre) y mostró niveles detectables en todos los puntos de tiempo posteriores a la ingestión en ambos días (día 1 y 3). (C) Concentraciones de medroxiprogesterona (MPA) medidas por el método LC-MS/MS en muestras de suero y orina recolectadas el día 0 (línea de base) y 21 y 60 días después de la inyección de depósito. Cuatro personas tenían MPA detectable en suero antes de recibir la inyección, dos de los cuales también tenían MPA detectable en orina. Las dos mujeres con MPA urinario indetectable pero MPA sérico detectable tenían niveles inferiores a los necesarios para la eficacia anticonceptiva (< 0,2 ng/mL). Un individuo con MPA sérico indetectable, tenía MPA urinario detectable, con un nivel en la orina ligeramente por encima del nivel umbral sérico (< 0,2 ng/mL). Detectamos MPA en suero y orina de todos los participantes a los 21 y 60 días posteriores a la inyección.

Los resultados de LC-MS/MS mostraron que todos los participantes tenían al menos un punto temporal en el que se detectó LNG en la orina. Solo ocho de 15 participantes tenían niveles detectables en los tres puntos de tiempo posteriores al inicio (Fig. 2A). Seis participantes tenían niveles de LNG por debajo del nivel de cuantificación en el punto de tiempo mínimo (24 h después de la dosis 2), tres de los cuales también tenían niveles indetectables seis horas después de su primera dosis (Fig. 2A). A todos menos a uno de los participantes se les detectó LNG por LC-MS/MS en la orina seis horas después de la tercera dosis posterior. En particular, a ese individuo se le detectó LNG en la orina después del primer y segundo punto de tiempo. Los niveles reales de GNL para todos los participantes que usan LCMS/MS y EIA se presentan en la Tabla 2S.

La Tabla 4 muestra la detección de MPA en muestras de orina y suero por LC-MS/MS para usuarios de MPA. De los 11 participantes con MPA indetectable en suero al inicio del estudio, 10 tenían muestras con MPA indetectable en orina, lo que corresponde al 91 % de especificidad previa a la dosis en orina. Cuatro individuos tenían MPA detectable en suero antes de recibir la inyección (Fig. 2C), dos de los cuales también tenían MPA detectable en orina. Ambos individuos con MPA detectado tanto en suero como en orina negaron haber recibido inyecciones previas de DMPA. Los dos participantes con MPA urinario indetectable pero MPA sérico detectable tenían niveles inferiores a los necesarios para la eficacia anticonceptiva (< 0,2 ng/mL). Informaron haber recibido inyecciones de DMPA más de 12 meses antes del inicio del estudio (15 y 17 meses, respectivamente). El individuo con MPA sérico indetectable tenía MPA urinario detectable, con el nivel en la orina ligeramente por encima del nivel umbral sérico (< 0,2 ng/mL). Detectamos MPA en suero y orina de todos los participantes a los 21 y 60 días después de la inyección (100 % de sensibilidad). En la Tabla 3S, ilustramos los niveles reales de MPA para todos los participantes que utilizan LC-MS/MS.

Nuestro análisis de secuenciación de ARN de muestras de saliva de los participantes que usaron DMPA reveló números variables de DEG en los tres puntos de tiempo (Tabla 5). La información en los mapas de calor biagrupados (Fig. 3A–C) ilustra el perfil visual de los DEG de las muestras obtenidas en los días 21 (D21) y 60 (D60) en comparación con las muestras de referencia (pre) y entre sí, ordenadas por sus valores p ajustados, y graficados con sus valores de expresión transformada log2. Para la comparación pre-versus D21 (3a) observamos 10 genes expresados ​​diferencialmente; nueve de estos genes estaban regulados al alza y uno estaba regulado a la baja. Para antes de D60 (3b) vimos cinco DEG; uno estaba regulado a la baja y cuatro estaban regulados al alza. Para la última comparación entre D21 y D60 (3c), hubo un total de 50 genes expresados ​​diferencialmente, de los cuales 32 estaban regulados a la baja y 18 estaban regulados al alza. Los gráficos de volcanes de la expresión génica en la saliva de los usuarios de DMPA según el cambio de pliegue y los valores de p ajustados representan DEG en diferentes intervalos de tiempo (Fig. 4A-C). Hemos enumerado los genes expresados ​​diferencialmente identificados por sus valores p ajustados más sus errores estándar e intervalos de confianza (IC) en la Tabla 4S. No detectamos ningún gen expresado diferencialmente en las muestras de saliva de las usuarias de AOC en comparación con el valor inicial.

(A–C) Un mapa de calor biagrupado que muestra el perfil de expresión visual de los principales genes expresados ​​diferencialmente ordenados por su valor p ajustado mediante el trazado de sus valores de expresión transformados log2 en muestras (generados mediante la prueba de Wald). (A) muestra la comparación previa versus D21 donde observamos 10 genes expresados ​​​​diferencialmente, de los cuales nueve estaban regulados al alza y uno estaba regulado a la baja. (B) muestra la comparación previa frente a D60, vimos cinco genes expresados ​​​​diferencialmente; uno estaba regulado a la baja y cuatro estaban regulados al alza. (C) muestra la última comparación entre D21 y D60, había un total de 50 genes expresados ​​diferencialmente, de los cuales 32 estaban regulados a la baja y 18 estaban regulados al alza.

(A–C) Gráficos de volcán para visualizar el perfil de expresión de los principales genes expresados ​​diferencialmente ordenados por su valor p ajustado mediante el trazado de sus valores de expresión transformados log2. Los DEG regulados a la baja se indican en rojo y los DEG regulados al alza se indican en azul.

Este estudio representa un esfuerzo novedoso dentro del campo de la anticoncepción para confirmar el uso individual de métodos hormonales mediante la medición de biomarcadores en muestras de orina y saliva. Pudimos demostrar que podemos medir hormonas nativas (LNG o MPA) en concentraciones bajas en la orina usando LC-MS/MS) en muestras obtenidas de participantes que usaron AOC o DMPA. La sensibilidad para LNG fue del 93 % [68-100 %] a las 6 h después de la dosis en el Día 3 y la sensibilidad para MPA fue del 100 % en los Días 21 y 60; la especificidad fue del 91% [59-100%]. Nuestros resultados brindan un fuerte apoyo para continuar con investigaciones adicionales para confirmar nuestros hallazgos con respecto al uso de muestras de orina para identificar un biomarcador del uso de anticonceptivos hormonales. Proponemos sintetizar los metabolitos de referencia presentes en la orina para LNG y MPA y medir las concentraciones de metabolitos en orina mediante LC-MS/MS. Se espera que las concentraciones de metabolitos sean mucho más altas que las hormonas intactas29,30,31, por lo que confiamos en que la medición de metabolitos urinarios específicos mejorará la sensibilidad y la especificidad y fomentará un mayor desarrollo del uso de muestras de orina como biomarcador del uso de anticonceptivos hormonales.

Hasta donde sabemos, nuestros resultados son los primeros que demuestran la capacidad de medir las concentraciones de LNG en muestras de orina utilizando el kit DetectX. En comparación con nuestros resultados utilizando la tecnología LC-MS/MS, las concentraciones de LNG en orina medidas por EIA fueron mucho más altas. Este resultado no fue sorprendente ya que el método EIA LNG se basa en anticuerpos policlonales que se unen tanto al LNG como a sus metabolitos. Necesitamos confirmar si este resultado de EIA se debió a la reacción cruzada de los metabolitos de LNG presentes en la orina con los anticuerpos anti-LNG policlonales utilizados en los kits DetectX y proponer sintetizar los metabolitos de referencia específicos para validar aún más el kit de EIA de LNG. para la medición correcta de LNG y metabolitos en la orina. De manera similar, los metabolitos de referencia ayudarán a aumentar la sensibilidad/especificidad de la medición de metabolitos en la orina mediante EIA, que puede ser un método más rentable y accesible para su uso en entornos de bajos recursos en comparación con la tecnología LC-MS/MS.

Nuestra exploración de muestras de saliva proporciona evidencia preliminar de que la saliva podría usarse para identificar un biomarcador del uso de anticonceptivos hormonales. Con base en la reciente identificación de la expresión génica diferencial en muestras de saliva obtenidas de pacientes con cáncer, que ha allanado el camino para explorar la saliva como un biomarcador para diversas afecciones32,33,34, planteamos la hipótesis de que el uso de anticonceptivos hormonales podría conducir a un aumento o disminución de la regulación de algunos genes selectivos en individuos que usan DMPA o un AOC. Como se ilustra en los mapas de calor, encontramos numerosos genes expresados ​​diferencialmente en el grupo que usó DMPA el día 21 y el día 60 en comparación con el inicio, la mayoría de los cuales se han descrito previamente en asociación con varias enfermedades o condiciones. Curiosamente, en nuestro estudio, los cambios que notamos parecen alinearse con los efectos adversos que algunas personas informan cuando usan DMPA. Tanto el aumento de peso35 como la alopecia36, por ejemplo, se notifican entre algunos usuarios de DMPA, y nuestro análisis de la expresión génica diferencial mostró que el gen CRTC (coactivador de transcripción regulado por CREB 3), que desempeña un papel en la obesidad35 y PRMT9 (proteína arginina metiltransferasa 9 ) gen que se ha asociado con disostosis mandibulofacial con alopecia estaban ambos regulados al alza. Además, identificamos que la N-acetiltransferasa1, que funciona en el catabolismo del folato37,38, estaba regulada a la baja. Este hallazgo es consistente con un informe de los Centros para el Control de Enfermedades que señala que es probable que los usuarios de DMPA se clasifiquen en el cuartil más bajo (≤ 6.2 ng/mL) para las concentraciones de folato sérico39. También identificamos que la proteína de unión a galectina-3 lgals3bp, que se considera un biomarcador tumoral clínico importante40,41,42, estaba regulada a la baja en los usuarios de DMPA. Curiosamente, se ha informado que el uso de DMPA induce una disminución drástica en la proliferación del epitelio endometrial e incluso se sugiere como agente quimiopreventivo en personas con síndrome de Lynch43. Se requieren más estudios de confirmación para demostrar si alguno de estos genes expresados ​​diferencialmente identificados para estas otras condiciones también podría servir como biomarcador en la saliva de los usuarios de DMPA.

Por el contrario, no detectamos ninguna expresión génica diferencial en las muestras de saliva de usuarias de AOC recolectadas a las 24 y 72 horas posteriores a la ingestión. El resultado negativo podría deberse a los breves puntos de tiempo y las secuencias que seguimos para la toma de muestras de saliva de las usuarias de AOC. Probablemente, los cambios en los niveles de ARNm en las usuarias de AOC fueron comparativamente pequeños después de solo 24 y 72 horas de uso. La capacidad de evaluar con precisión la presencia de hormonas en la saliva depende de la naturaleza bioquímica de las hormonas y del mecanismo por el cual las hormonas, por ejemplo, LNG, ingresan a la cavidad oral44,45. Por lo tanto, los cambios genéticos indetectables en usuarias de AOC después de 24 a 72 h de uso pueden estar relacionados con el mecanismo de transporte específico de LNG a la saliva, que debe explorarse más a fondo.

Además, en este estudio, solo realizamos la secuenciación del ARN total que detecta principalmente el ARN codificante. Los resultados de estudios recientes han demostrado que el ARN no codificante largo y el microARN pueden interactuar a través de varios mecanismos para regular el ARNm46. Los esfuerzos de investigación futuros en los que aplicamos períodos más largos de uso de AOC (y tiempos de recolección de saliva), así como la secuenciación de microARN que consultan miles de pequeñas secuencias de ARN no codificantes con una sensibilidad sin precedentes, pueden permitirnos identificar genes expresados ​​​​diferencialmente en usuarios de AOC.

Este estudio tuvo varias fortalezas y limitaciones. Nuestros resultados que demuestran que el muestreo de orina se puede utilizar para identificar un biomarcador del uso de anticonceptivos hormonales han sentado las bases para un mayor desarrollo, incluido un camino hacia la identificación de métodos de diagnóstico que utilizan el muestreo de orina que se aplican de manera fácil y generalizada. El hecho de que no utilizáramos la tecnología de derivatización para medir los niveles hormonales fue una limitación del estudio. Con este método, es probable que hayamos aumentado la detección de niveles más bajos de hormonas en las muestras de orina y que hayamos mejorado la sensibilidad de nuestros resultados para detectar el uso de COC y DMPA. Otra limitación fue que no medimos los niveles sanguíneos iniciales de LNG/MPA de los voluntarios antes de iniciar el tratamiento con AOC o DMPA. Estos puntos de datos podrían haber mejorado nuestros resultados de especificidad obtenidos de las muestras de orina.

Con respecto a nuestros resultados con saliva, nuestros resultados positivos en usuarias de DMPA sugieren que podemos usar este fluido corporal de fácil obtención para identificar biomarcadores del uso de anticonceptivos hormonales. El uso de la tecnología de secuenciación de ARN solo para esta fase del estudio puede habernos impedido mostrar cualquier expresión diferencial en la saliva de las usuarias de AOC y fue una debilidad del estudio. Además, es posible que los cambios en la expresión de genes salivales sean acumulativos y, por lo tanto, el breve período de tiempo que utilizamos para explorar dichos cambios representó una debilidad adicional. Tendremos que realizar más investigaciones para evaluar los efectos de una exposición más prolongada al uso de COC en la expresión génica diferencial, y aplicar la secuenciación de micro ARN para obtener información adicional para determinar si se justifica una mayor exploración para usar muestras de saliva para detectar biomarcadores del uso de COC.

En general, las posibilidades planteadas por nuestros resultados sugieren que podemos usar la orina o la saliva para desarrollar nuevos biomarcadores indicativos del uso de anticonceptivos hormonales que podrían aplicarse en la investigación de salud pública y también tener implicaciones para la investigación clínica y la atención clínica.

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Este estudio fue apoyado por un Sub acuerdo de la Universidad Johns Hopkins con fondos provistos bajo la Subvención No. OPP1172551 (Mejora de la Medición y el Diseño del Programa) de la Fundación Bill y Melinda Gates. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Fundación Bill y Melinda Gates o la Universidad Johns Hopkins. Agradecemos al Dr. George Creasy por su orientación sobre el desarrollo del protocolo y el seguimiento médico del ensayo; a la Dra. Lisa Haddad por su cuidadosa revisión y edición de varios borradores del manuscrito; a Lorna Begg por su ayuda con el formato final; ya Craig Savel y Divea Venkatasetty por su asistencia en la gestión de datos. Nos gustaría agradecer a las 30 mujeres que participaron en el estudio.

Centro de Investigación Biomédica, Consejo de Población, 1230 York Avenue, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Rakhee Sachdeva, Narender Kumar, Barbara A. Friedland, Marlena Plagianos, Shimin Zhang, Larisa Kizima y Ruth B. Merkatz

Clinica de Profamilia, Nicolas de Ovando Esq. Calle 16, Ens. Luperon, Santo Domingo, Dominican Republic

Vivian Brache, Leila Cochon & Ana Sofía Tejada Tabar

Cañón del Oro, Estados Unidos

ann blanc

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RS conceptualizó y planificó los experimentos utilizando la saliva como biomarcador para el uso de anticonceptivos, seleccionó los datos de las muestras de saliva, analizó los datos de EIA y LCMS para orina y suero y escribió/editó las secciones técnicas del manuscrito. NK conceptualizó y planificó los experimentos utilizando la orina como biomarcador para el uso de anticonceptivos hormonales, supervisó y seleccionó los resultados de LNG y MPA de muestras de suero y orina, contribuyó al desarrollo del protocolo y escribió/editó las secciones técnicas del manuscrito. VB realizó y supervisó la recopilación de datos, incluidos los procedimientos de contratación y consentimiento informado como investigador principal en el sitio clínico. BF coescribió el protocolo del estudio, capacitó al personal del estudio, realizó el monitoreo (remoto) del sitio clínico de acuerdo con las Buenas Prácticas Clínicas y contribuyó a escribir/editar el manuscrito. MP desarrolló planes de gestión de datos y análisis estadístico, revisó todos los datos del sitio clínico y desarrolló, realizó análisis de sensibilidad y especificidad para datos de suero y orina, y contribuyó a escribir/editar el manuscrito. SZ analizó todas las muestras de COC y MPA mediante LCMS/MS. LK realizó todos los experimentos de EIA en todas las muestras de orina. LC llevó a cabo procedimientos con voluntarios del estudio en el sitio de estudio y manejó todas las muestras como se describe en el protocolo. AST llevó a cabo los procedimientos con los voluntarios del estudio en el sitio del estudio y manejó todas las muestras como se indica en el protocolo. AB inició la exploración de biomarcadores para el uso de anticonceptivos hormonales, aseguró la financiación del estudio y contribuyó al desarrollo del protocolo. RBM conceptualizó y co-desarrolló el estudio y el protocolo del estudio, supervisó el proyecto y escribió la mayor parte del manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia con Ruth B. Merkatz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sachdeva, R., Kumar, N., Brache, V. et al. Nuevos enfoques para el desarrollo de biomarcadores del uso de anticonceptivos hormonales. Informe científico 13, 245 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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Recibido: 10 diciembre 2021

Aceptado: 11 noviembre 2022

Publicado: 05 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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