El agotamiento juvenil de microglia reduce la orientación pero no la selectividad de alta frecuencia espacial en el ratón V1

May 28, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12779 (2022) Citar este artículo

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Una corrección del editor de este artículo se publicó el 24 de enero de 2023

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Microglia contiene múltiples mecanismos que dan forma al paisaje sináptico durante el desarrollo posnatal. Sin embargo, aún no se sabe bien si los cambios sinápticos mediados por la microglía reflejan el refinamiento del desarrollo de las respuestas neuronales en las cortezas sensoriales. En la vida posnatal, el desarrollo de una mayor orientación y selectividad de frecuencia espacial de las respuestas neuronales en la corteza visual primaria (V1) respalda la aparición de una alta agudeza visual. Aquí, utilizamos el inhibidor del receptor del factor 1 estimulante de colonias (CSF1R) PLX5622 para agotar rápida y duraderamente la microglía en ratones durante el período juvenil en el que emerge una mayor orientación y selectividad de frecuencia espacial. Las propiedades de sintonización excitatoria e inhibitoria se midieron simultáneamente utilizando imágenes de calcio multifotónicas en la capa II/III de V1 de ratón. Descubrimos que el agotamiento de la microglía generalmente aumentaba la actividad evocada que, a su vez, reducía la selectividad de orientación. Sorprendentemente, no se requería microglía para la aparición de respuestas sintonizadas de alta frecuencia espacial. Además, el agotamiento de la microglía no perturbó la binocularidad cortical, lo que sugiere un procesamiento de profundidad normal. Juntos, nuestro hallazgo de que la orientación y la selectividad de alta frecuencia espacial en V1 son compatibles diferencialmente con la microglía revelan que la microglía requiere un procesamiento sensorial normal, aunque de manera selectiva.

A través de múltiples sistemas sensoriales, la experiencia guía la maduración funcional de los circuitos neuronales durante períodos de mayor plasticidad conocidos como períodos críticos1,2,3,4,5. Las experiencias anormales durante estas ventanas juveniles pueden perturbar la codificación sensorial y la percepción hasta bien entrada la edad adulta6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Los estudios de imágenes in vivo de las espinas sinápticas revelan que los períodos críticos coinciden con cambios transitorios en la estabilidad de la espina16,17,18. Es importante destacar que la privación sensorial durante los períodos críticos produce cambios estructurales en las sinapsis que se cree que reflejan la reorganización funcional16,17,19,20,21. Por lo tanto, los tipos de células que regulan la estructura de la sinapsis pueden desempeñar un papel importante en el refinamiento de las propiedades funcionales del circuito sensorial.

Microglia juega múltiples roles en la configuración de circuitos cerebrales juveniles y adultos21,22,23. Durante el desarrollo, se ha demostrado que la microglía modifica la conectividad sináptica a través de la eliminación de sinapsis24,25,26,27,28,29, la inducción de la columna vertebral30 y la trogocitosis31. En adultos, la microglía amortigua la actividad del circuito cortical a través de la dinámica dependiente de Gi32 y al convertir el ATP extracelular en adenosina33, un potente depresor de la actividad neuronal34. La participación de la microglía en las modificaciones de la sinapsis y la actividad del circuito sugiere que pueden estar involucradas en los mecanismos del período crítico. En apoyo, la eliminación de la microglía usando inhibidores del receptor del factor 1 estimulante de colonias (CSF1R)35 aumenta tanto la conectividad sináptica como la excitabilidad del circuito en la corteza visual primaria (V1)36,37.

Durante el desarrollo del sistema visual, se cree que la maduración del procesamiento visual binocular involucra los mecanismos de la microglía. En el núcleo geniculado lateral posnatal temprano (GNL), la actividad retiniana impulsa la eliminación de la entrada binocular excesiva de la retina, lo que conduce a una mayor segregación de las vías visuales específicas del ojo38,39,40,41. La eliminación de sinapsis por microglia se ha implicado en el esculpido de entradas retinales a LGN26,27,28. Si bien estos estudios proporcionan pruebas sólidas del papel de la microglía en el refinamiento anatómico de los circuitos visuales, no abordan la función. Recientemente, se descubrió que la desactivación de los mecanismos del complemento evita la poda mediada por microglía de las entradas retinianas en desarrollo a LGN26. Curiosamente, esta perturbación anatómica en LGN no perturba la binocularidad ni su plasticidad aguas abajo en V142, lo que destaca la importancia de evaluar la función del circuito.

Más allá de la binocularidad, no se ha evaluado el papel de la microglía en la configuración de las propiedades funcionales de las respuestas neuronales que respaldan la visión de alta agudeza, como la orientación y la selectividad de frecuencia espacial6,11,14,43,44,45,46,47,48. En el sistema visual, las neuronas selectivas de orientación exhiben fuertes preferencias por la orientación de estímulos visuales alargados1,43,49,50,51. Además, las neuronas responden a una frecuencia espacial específica de patrones visuales repetidos1,43,50,51,52. Antes de abrir los ojos, las neuronas V1 tienen baja orientación y selectividad de frecuencia espacial. En las semanas posteriores a la apertura de los ojos, las neuronas aumentan su selectividad a la orientación del estímulo y sus preferencias de frecuencia espacial cambian hacia estímulos más finos11,53,54,55,56,57. El refinamiento dependiente de la experiencia de estas propiedades de sintonización en V1 está fuertemente asociado con los límites perceptivos de la agudeza visual14,45,47,58,59,60.

Para determinar la contribución de la microglía al refinamiento y mantenimiento de las respuestas visuales, realizamos imágenes de calcio de dos fotones en V1 LII/III después del agotamiento de la microglía a largo plazo. Probamos múltiples orientaciones y frecuencias espaciales a través de cada ojo para caracterizar la selectividad neuronal51,61. Si bien se esperaba y observó hiperexcitabilidad, nos sorprendió descubrir que el agotamiento de la microglía solo redujo la selectividad de orientación. Por el contrario, encontramos que la aparición del desarrollo de neuronas sintonizadas de alta frecuencia espacial se produjo a pesar del agotamiento de la microglía. Además, encontramos que la binocularidad de las neuronas V1 es similar independientemente de la supervivencia de la microglía. Juntos, estos datos proporcionan evidencia convincente de que la microglía se requiere específicamente para la aparición de una alta selectividad de orientación en V1.

En ratones adultos, tres días de tratamiento con el inhibidor selectivo de CSF1R PLX5622 (1200 ppm en comida) elimina la mayor parte de la microglía del cerebro adulto62. Queríamos determinar si ocurrirían tasas de agotamiento comparables en los juveniles. Con este fin, destetamos a los ratones P18 y los alimentamos con una dieta de control o PLX5622 chow hasta que recolectamos cerebros para la tinción de inmunofluorescencia (Fig. 1A). Visualizamos la microglía mediante la tinción con IBA1 (Fig. 1B) y encontramos que PLX5622 elimina rápidamente > 99 % de la microglía del V1 juvenil (Fig. 1C). Es importante destacar que la dieta continuada con PLX5622 mantuvo > 96 % de agotamiento de la microglía hasta bien entrada la edad adulta (Fig. 1D).

Agotamiento rápido y sostenido de la microglía juvenil con comida PLX5622. (A) Línea de tiempo para evaluar el grado de agotamiento de la microglía después de la administración de comida PLX5622. (B) Imágenes de ejemplo de secciones de cerebro P22 teñidas para Iba1 siguiendo la dieta de control (arriba) y PLX5622 (abajo). V1 se muestra a la derecha. (C) El número de microglia juvenil se reduce en más del 99 % en ratones alimentados con comida PLX5622 (control juvenil (4 ratones) = 142,5 ± 12,6 frente a PLX5622 juvenil (4 ratones) = 1,5 ± 1,2, prueba t de Welsch: t = 11,2 , gl = 3,1, p = 0,0015). (D) El tratamiento continuo con PLX5622 mantiene el número suprimido de microglía adulta (control adulto = 161,2 ± 8,9 frente a PLX6722 adulto = 6,8 ± 2,8; prueba t de Welsch: t = 16,6, df = 6,0, p < 0,001). Las barras de error representan el SEM

La mejora de la agudeza visual después de abrir los ojos coincide con la maduración de las propiedades de ajuste de V111,47,59,63,64. Para determinar el papel de la microglía en el refinamiento dependiente de la experiencia de la sintonización V1, utilizamos microscopía de dos fotones para registrar señales de calcio evocadas visualmente en ratones control juveniles y adultos, y en ratones adultos alimentados con PLX5622 (Fig. 2a). En el momento de la grabación, a los ratones se les presentó una batería de estímulos visuales que consistían en rejillas a la deriva que abarcaban 7 frecuencias espaciales (0,015–0,96 cpd espaciadas logarítmicamente) y 12 direcciones (0°–330°) (Fig. 2b). Los estímulos se aleatorizaron y se presentaron 10 veces a cada ojo por separado. Las neuronas inhibidoras se identificaron en función de la expresión de la proteína de fluorescencia roja tdTomato en células que expresan el transportador vesicular de aminoácidos inhibidores (VGAT) (Fig. 2c).

Selectividad de orientación reducida después del agotamiento de microglia. ( a ) Cronología para la obtención de imágenes de dos fotones de las propiedades de sintonización en ratones juveniles y adultos criados normalmente (arriba) y ratones adultos alimentados con comida PLX5622 a partir de P18 (abajo). ( b ) Configuración experimental para evaluar la actividad evocada visualmente de una sola célula utilizando rejillas de deriva. ( c ) Un ejemplo de vista de dos fotones de un ratón transgénico V1 de VGAT-tdT inyectado con AAV-Syn-GCaMP6s. ( d ) Ejemplo de señal de calcio evocada visualmente para presentaciones de estímulos a través del ojo contralateral en adulto V1. El eje x está organizado por la dirección de la rejilla. El eje y está organizado aumentando la frecuencia espacial de la rejilla. Las líneas negras finas y gruesas representan trazas promediadas individuales y de prueba, respectivamente. La línea azul representa las respuestas promediadas en diferentes direcciones en la frecuencia espacial máxima de la neurona. Esta traza promediada de prueba se usó para generar la curva de ajuste de orientación de la neurona y la selectividad de orientación. ( e ) La curva de ajuste de orientación para la neurona de ejemplo en ( d ). ( f, g ) Las curvas de sintonización individuales se desplazaron alrededor de la dirección preferida y se promediaron para cada animal. ( f ) Las curvas de ajuste de orientación de la población para neuronas excitatorias en juveniles (gris), adultos (azul) y adultos en Chow PLX5622 (rojo). ( g ) Las curvas de ajuste de orientación de la población para neuronas inhibidoras en juveniles (gris), adultos (azul) y adultos alimentados con comida PLX5622 (rojo). El OSI para neuronas excitatorias (h) e inhibitorias (i). Los diagramas de violín representan la distribución de la población en ratones de control juveniles (gris) y adultos (azul) y adultos en PLX5622 (rojo). Los círculos negros representan el OSI medio de un animal. (h) Durante el desarrollo normal, la OSI aumenta en las neuronas excitatorias (Control juvenil = 0,48 ± 0,02 frente a Control adulto = 0,57 ± 0,02, p = 0,007). El OSI de PLX5622 adulto (0,50 ± 0,02) fue menor que el de los controles adultos (p = 0,024) y comparable al control juvenil (p = 0,525). (i) Durante el desarrollo normal, hay un aumento en el OSI para las neuronas inhibidoras (Control juvenil = 0,29 ± 0,02 frente a Control adulto = 0,36 ± 0,03, p = 0,05). El OSI de los ratones adultos PLX5622 (0,33 ± 0,03) estuvo en el medio, pero no fue diferente, de los juveniles de control (p = 0,294) y adultos (p = 0,330). nJuvenileControl = 9 ratones, nAdultControl = 9 ratones, nAdultPLX5622 = 11 ratones. Las barras de error representan el SEM

La neurona típica en el adulto V1 responde fuertemente a unas pocas rejillas de deriva que son opuestas en direcciones43,50,65 (Fig. 2d). La curva de ajuste de orientación para la neurona de ejemplo se calculó tomando las respuestas para todas las orientaciones en la frecuencia espacial que evoca la respuesta más fuerte (Fig. 2e). Para visualizar la selectividad de orientación en la población de neuronas excitatorias (Fig. 2f) e inhibitorias (Fig. 2g), las curvas de ajuste de orientación se desplazaron y centraron alrededor de la dirección preferida. El promedio de estas curvas de ajuste de población revela que los niveles de actividad evocada en la mayoría de las direcciones fueron más altos en los juveniles (gris) y en los adultos alimentados con PLX5622 (rojo) que en los adultos de control (azul) (Fig. 2f, g). Para cuantificar una selectividad de orientación neuronal, calculamos su índice de selectividad de orientación (OSI), que proporciona un valor resumen que considera las respuestas en todas las orientaciones. Una neurona con un OSI de 0 responde a todas las orientaciones con igual magnitud. Una neurona con un OSI de 1 responde a una sola orientación. De acuerdo con estudios previos, la neurona excitatoria OSI aumenta entre las edades juvenil y adulta (Fig. 2h). El OSI de ratones adultos alimentados con comida PLX5622 fue comparable a los de ratones juveniles y no adultos (Fig. 2h). De manera similar, el OSI de las neuronas inhibidoras de ratones alimentados con comida PLX5622 no fue diferente de los juveniles (Fig. 2i).

La aparición de neuronas sintonizadas de alta frecuencia espacial en los circuitos visuales adultos es un sello distintivo del desarrollo del período crítico. La neurona típica en el adulto V1 es fuertemente selectiva para estímulos de frecuencia espacial media a alta (Fig. 3a)51,64. La curva de sintonización de frecuencia espacial para la neurona de ejemplo se calculó tomando las respuestas de todas las frecuencias espaciales en la dirección preferida (Fig. 3b). La frecuencia espacial con la magnitud de respuesta más alta se considera la frecuencia espacial pico de esa neurona. Durante el desarrollo normal, hay un cambio hacia frecuencias espaciales máximas más altas tanto en las neuronas excitatorias (Fig. 3c) como en las inhibidoras (Fig. 3d). El agotamiento de Microglia no impidió el cambio de desarrollo hacia frecuencias espaciales más altas en ambas poblaciones neuronales (Fig. 3c, d).

La microglía no es necesaria para el surgimiento del desarrollo de la sintonización de alta frecuencia espacial ni para el mantenimiento de la binocularidad normal en V1. ( a ) Ejemplo de señal de calcio evocada visualmente para presentaciones de estímulos a través del ojo contralateral en un adulto V1. El eje x está organizado por la dirección de la rejilla. El eje y está organizado aumentando la frecuencia espacial de la rejilla. Las líneas negras finas y gruesas representan trazas promediadas individuales y de prueba, respectivamente. La línea azul a 120° representa las respuestas promediadas a diferentes direcciones de frecuencias espaciales en la dirección preferida de la neurona. Esta traza promediada de prueba se usó para generar la curva de ajuste de frecuencia espacial de esta neurona y la frecuencia espacial máxima. (b) La curva de sintonización de frecuencia espacial para la neurona de ejemplo en (a). La frecuencia espacial máxima para las neuronas excitatorias (c) e inhibitorias (d). Los diagramas de violín representan la distribución de la población en ratones de control juveniles (grises) y adultos (azules) y adultos en Chow PLX5622 (rojo). Los círculos negros representan la frecuencia espacial máxima media de un animal. (c) Durante el desarrollo normal, las neuronas excitatorias se desplazan hacia frecuencias espaciales más altas (Control juvenil = 0,08 ± 0,01 frente a Control adulto = 0,12 ± 0,01, p = 0,035). La frecuencia espacial máxima de los ratones alimentados con PLX5622 (0,16 ± 0,02) fue mayor que la de los juveniles (p = 0,002) y comparable a la de los ratones de control adultos (p = 0,253). (d) Al igual que su contraparte excitadora, las neuronas inhibidoras se desplazan hacia frecuencias espaciales más altas durante el desarrollo normal (Control juvenil = 0,08 ± 0,02 frente a Control adulto = 0,15 ± 0,02, p = 0,043). La frecuencia espacial máxima de los ratones alimentados con PLX5622 (0,18 ± 0,03) fue mayor que la de los juveniles (p = 0,006) y comparable a la de los ratones de control adultos (p = 0,450). Histograma del índice de dominancia ocular para neuronas excitatorias (e) e inhibidoras (f) en juveniles (gris), adultos (azul) y ratones que carecen de microglía (rojo). El agotamiento de la microglía no alteró la binocularidad establecida de las neuronas en V1 (control juvenil = 0,45 ± 0,08 frente a control adulto = 0,30 ± 0,08 cpd, frente a PLX5622 adulto = 0,36 ± 0,11). nJuvenileControl = 9 ratones, nAdultControl = 9 ratones, nAdultPLX5622 = 11 ratones. Las barras de error representan el SEM

Otra característica distintiva del desarrollo del período crítico es el surgimiento y la estabilidad funcional de la binocularidad. Las neuronas binoculares generalmente responden con más fuerza a la estimulación que se muestra a través de un ojo que a otro. Esta característica se puede cuantificar mediante el índice de dominancia ocular (ODI). Un valor de -1 y 1 ODI representa una célula que responde solo a la estimulación ocular ipsilateral y contralateral, respectivamente. En todos los grupos, la actividad evocada de las neuronas excitatorias (Fig. 3e) es menos binocular (ODI sesgado hacia 1) que su contraparte inhibitoria (Fig. 3f). El patrón conservado de binocularidad más fuerte en las neuronas inhibitorias sugiere que el agotamiento de la microglía no perturba el procesamiento binocular en V1.

Se cree que la reorganización de la conectividad sináptica subyace a la maduración de los circuitos sensoriales dependiente de la experiencia21. En el sistema visual, mientras que la microglía respalda la conectividad posnatal a través de la eliminación de sinapsis26,27,28,29, su contribución al desarrollo de la sintonía neuronal no está clara. En este estudio, abordamos el papel que desempeña la microglía en el refinamiento de la sintonía neuronal durante un período crítico para el desarrollo de V1 al agotarlos utilizando el inhibidor de CSF1R PLX5622. Encontramos que la eliminación de la microglía elevó la actividad evocada y redujo la selectividad de orientación al tiempo que ahorró la selectividad de alta frecuencia espacial y la binocularidad. Nuestras observaciones proporcionan una disociación de los mecanismos que respaldan la selectividad de orientación de aquellos que respaldan la selectividad de alta frecuencia espacial.

Elegimos usar el inhibidor de CSF1R PLX5622 debido a su eficacia bien documentada en la ablación rápida de microglia66,67,68,69. Debido a la naturaleza farmacológica del paradigma, otras células que expresan CSF1R en el cuerpo habrán alterado la señalización de CSF1R; sin embargo, la microglía y los macrófagos cerebrales parecen depender únicamente de la señalización de CSF1R para sobrevivir70 y, por lo tanto, no se produce una eliminación total de otras poblaciones mieloides. También se han desarrollado enfoques genéticos para la eliminación de la microglía y se han desarrollado varias líneas impulsoras de Cre que pueden dirigirse selectivamente a la microglía sobre otras poblaciones mieloides, como TMEM11971 y Hexb72. La combinación de estas líneas con ratones con expresión de toxina diftérica dependiente de Cre mata rápidamente a la población microglial, pero da como resultado una tormenta de citocinas y una rápida repoblación de las células supervivientes73,74,75. Ni una tormenta de citocinas ni la repoblación se producen con los tratamientos con inhibidores de CSF1R que agotan la microglía70. Cabe señalar que, si bien los inhibidores de CSF1R representan el mejor enfoque actual para el agotamiento de la microglia, dan como resultado la eliminación de la microglia en todo el cerebro35. Por lo tanto, no podemos concluir que nuestras observaciones en V1 se deban a la pérdida local de microglía. Además, nuestro estudio no puede excluir el papel de otras células mieloides en el apoyo a la alta selectividad de orientación V1. La combinación de una proteína inhibidora de CSF1R secretada y dependiente de Cre76 con la administración local de un AAV-Cre bajo promotores específicos de neuronas77 y serotipos78 puede resultar útil para probar si el agotamiento local sostenido de la microglía en V1 reproduce nuestros resultados.

Nuestros datos sugieren un papel selectivo y necesario para la microglía en el aumento de la selectividad de orientación. Una explicación es que la microglía funciona como neuronas inhibidoras, que dan forma al ajuste cortical al aumentar el umbral de excitabilidad, lo que hace que la salida de picos excitatorios sea más selectiva56,79. Por lo tanto, en ausencia de microglía, las neuronas pueden volverse más excitables y aumentar efectivamente la capacidad de respuesta a estímulos no preferidos, lo que podría reducir la selectividad de orientación. De hecho, en un modelo de ratón para el síndrome de Angelman, el aumento de la excitabilidad neuronal intrínseca coincide con una reducción de la selectividad de orientación en V180. En apoyo de un mecanismo de excitabilidad, se ha demostrado que la transmisión sináptica espontánea de neuronas inhibidoras de parvalbúmina (PV) y excitatorias en V1 aumenta después del agotamiento de la microglía36,37. Por lo tanto, los mecanismos de microglía que regulan la excitabilidad de todo el circuito pueden contribuir al refinamiento del desarrollo de las propiedades de sintonización.

La orientación y la selectividad de frecuencia espacial son en gran medida separables en el tiempo y el espacio81,82,83. Además, recientemente se ha descubierto que algunas moléculas sinápticas son necesarias para el refinamiento de determinadas propiedades de respuesta cortical59,84,85,86. Por lo tanto, es posible que la microglía reconozca y modifique las sinapsis con propiedades de sintonización específicas. De hecho, en el sistema retinogeniculado en desarrollo, los marcadores moleculares asociados a la actividad en las neuronas le indican a la microglía qué sinapsis debe eliminar24,26,27. Por lo tanto, nuestro hallazgo de que la microglía se requiere selectivamente para el refinamiento de la selectividad de orientación puede reflejar la capacidad de la microglía para reconocer etiquetas sinápticas únicas vinculadas a las propiedades de sintonización.

En contraste con las neuronas, la microglía es más pequeña y cubre el cerebro con poca superposición de sus procesos móviles. Por lo tanto, la densidad del mosaico puede establecer la escala espacial en la que la microglía puede participar en la eliminación de sinapsis diferencial. Se ha establecido que, al menos para la selectividad de orientación, las preferencias de las entradas sinápticas a una neurona individual solo predicen débilmente su preferencia de orientación general87,88. Recientemente, se ha descubierto que las sinapsis con preferencias de orientación como las de la neurona principal están estrechamente correlacionadas en el tiempo y se agrupan a lo largo del árbol dendrítico89,90,91. La agrupación de sinapsis funcionalmente similares crea puntos calientes de actividad que, por lo tanto, pueden involucrar diferencialmente la eliminación e inducción de sinapsis mediada por microglía. Si la selectividad de la binocularidad y la frecuencia espacial de las sinapsis a lo largo del árbol dendrítico se distribuyen de manera más homogénea, la microglía puede participar de una manera que no sesga la distribución general de esas propiedades de sintonización. Para comprender mejor el papel de la microglía en el desarrollo del circuito sensorial, los estudios futuros deberían investigar una relación entre el contacto microglial y la distribución de las propiedades de sintonización sináptica en el árbol dendrítico.

Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en medir el refinamiento del desarrollo de la sintonización en poblaciones de neuronas GABAérgicas de capa II/III V1. De acuerdo con otros, encontramos que las neuronas inhibitorias adultas son menos selectivas a la orientación del estímulo que las neuronas excitatorias50,92,93. Nuestro análisis no se separó por tipo inhibitorio. Estudios de desarrollo previos muestran que la selectividad de orientación de las neuronas inhibitorias de la parvalbúmina (PV) se reduce durante el desarrollo juvenil56,94,95. Aquí, mostramos que la población inhibitoria se vuelve más selectiva a la orientación del estímulo. Esto puede reflejar una divergencia en el desarrollo funcional de las neuronas PV de la otra clase principal de neuronas inhibidoras, las células que expresan somatostatina (SST)96,97,98. De hecho, las células SST en adultos V1 muestran una selectividad de orientación que es comparable a las neuronas excitatorias99. Si las neuronas SST inmaduras tienen una selectividad de orientación reducida, nuestro aumento observado en el desarrollo de la selectividad de orientación para las neuronas inhibidoras en la capa II/III puede estar impulsado por el desarrollo de SST. Los estudios futuros pueden revelar efectos más específicos del agotamiento de microglia en diferentes subtipos de células corticales.

Si bien nuestras observaciones se limitaron a V1, los efectos del agotamiento de la microglia en la maduración de la selectividad de orientación pueden extenderse a otros circuitos visuales. Aunque la selectividad de alta orientación emerge predominantemente en V1 de la vía visual primaria, las neuronas del colículo superior (SC) de la vía visual extrageniculada exhiben una selectividad débil a la orientación del estímulo100. El SC es un circuito visual crucial para las respuestas orientadas guiadas espacialmente101,102. Es importante destacar que los distintos tipos de células SC103 respaldan el comportamiento de evitación de depredadores104 y de captura de presas105. Si la microglía admite la selectividad de orientación a través de los circuitos visuales, su agotamiento puede perturbar la selectividad de orientación en SC, lo que podría alterar el comportamiento de presa-depredador.

Hasta la fecha, la relación entre la eliminación de sinapsis de microglía y la función del circuito neural se ha limitado a amplios cambios en la actividad del circuito. Es importante destacar que, hasta este estudio, no se había evaluado directamente el papel de la microglía en el desarrollo de la sintonía neuronal durante la experiencia visual normal. Aquí encontramos un impacto selectivo pero duradero en la función del circuito cuando se eliminan las microglías a partir del desarrollo juvenil. Aunque las neuronas sintonizadas de alta frecuencia espacial emergen en V1 empobrecido en microglía, la selectividad de orientación embotada por sí sola probablemente perjudique la agudeza visual del animal. Nuestro estudio proporciona evidencia convincente del papel clave de la microglía en el desarrollo posnatal de los sistemas sensoriales y sugiere que las deficiencias de la microglía durante los períodos críticos posnatales pueden conducir a déficits sutiles pero duraderos en el procesamiento sensorial.

Para visualizar las neuronas inhibitorias, se cruzaron ratones que albergaban el reportero tdTomato dependiente de Cre (Ai14, JAX 007914) con ratones que expresaban Cre recombinasa bajo el control del promotor Vesicular GABA Transporter (VGAT) (VGAT-ires-Cre106, JAX 028862). Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad (12/12 h). Todos los experimentos tuvieron lugar durante el ciclo de luz y utilizaron tanto ratones machos como hembras. Todos los protocolos y procedimientos experimentales fueron aprobados y siguieron las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de California, Irvine. Este estudio se informa de acuerdo con las pautas ARRIVE.

PLX5622 fue proporcionado por Plexxikon Inc. y formulado en comida estándar AIN-76A por Research Diets Inc. a 1200 mg/kg. Todos los ratones se destetaron en P18 y los compañeros de camada se dividieron en dos grupos: (1) comida PLX5622 y (2) comida de control. Para fomentar la alimentación, se dopó 1 gránulo por ratón por día hasta la cuarta semana posnatal. Esto fue particularmente importante para los ratones recién destetados que tienen dificultades para llegar a la tolva de comida.

Los ratones se anestesiaron con isoflurano (Patterson Veterinary) en O2 (2 % para inducción, 1–1,5 % para mantenimiento). Se administró carprofeno inyectable (10 mg/kg sc, Zoetis) para proporcionar analgesia perioperatoria. Se administró solución de lactato de Ringer (0,5 ml/20 g/h, sc) para reponer la pérdida de líquido. Los ojos se protegieron de la deshidratación con pomada ocular estéril (Rugby, Livonia, MI). Todas las herramientas quirúrgicas se esterilizaron utilizando un esterilizador de perlas de vidrio caliente (Germinator 500). Los ratones se recuperaron en su jaula de casa sobre una almohadilla térmica caliente hasta que se reanudó el comportamiento normal de alimentación y aseo. El cuidado postoperatorio consistió en inyecciones diarias de carprofeno durante al menos 2 días después de la implantación de la placa craneal y 5 días después de las cirugías de ventana craneal.

Después de la depilación y la esterilización con povidona yodada, el cuero cabelludo se cubrió con gel de clorhidrato de lidocaína al 2% tópico (Akorn) durante al menos 5 minutos. Se extirparon el cuero cabelludo y el tejido conjuntivo subyacente para exponer el hueso parietal e interparietal. Se inyectó clorhidrato de lidocaína (1%) en el temporal derecho, que posteriormente se separó (mitad posterior) del cráneo. El cráneo se secó con etanol (70% en agua DI) y se aplicó una capa delgada del adhesivo tisular Vetbond (3 M). Se fijaron al cráneo placas de cabeza de titanio impresas a medida (Star Rapid) utilizando la resina acrílica Ortho-Jet BCA (Lang Dental).

Para monitorear la actividad neuronal, utilizamos el indicador de calcio codificado genéticamente GCaMP6s (Penn Vector Core) bajo el promotor específico de neuronas Synapsin77 (1 × 1012 GC/mL). Para las grabaciones juveniles, los neonatos (P2-5) se anestesiaron con hielo y se bajó una micropipeta de vidrio biselado (~ 100 μm de diámetro de punta) perpendicular a ~ 3,5 mm lateral y 1 mm anterior a la confluencia de los senos paranasales. La micropipeta se hizo avanzar rápidamente en la corteza a una profundidad de ~ 700 µm por debajo de la superficie y se usó un manipulador hidráulico (Narishige, MO-10) para inyectar el virus (200–400 nL, 200 nL/min). Se usaron mapas retinotópicos posteriores (consulte la sección "Imágenes ópticas de señales intrínsecas") para confirmar que el virus se inyectó en V1 binocular. Para grabaciones de adultos, la entrega viral a V1 se guió por mapas retinotópicos dentro de 1 semana después de la implantación de la placa de cabeza. Se hizo un agujero de trepanación sobre el bV1 central hasta que quedó expuesta una pequeña región de la duramadre. Se usó una punta de jeringa para cortar la duramadre para evitar la ruptura de los vasos sanguíneos y el daño tisular debido a que la micropipeta empujaba hacia abajo el cerebro antes de la penetración. El virus se inyectó a una profundidad de 350 µm por debajo de la duramadre a 6,66 nL/min. Para este estudio no se utilizaron ratones con roturas de vasos cerebrales. Descubrimos que múltiples capas delgadas de Vetbond (que se eliminaron inmediatamente con Kimwipes) sobre el orificio de trepanación protegieron el cráneo y no causaron daño visible como se observó después de la extracción del cráneo durante la cirugía de ventana craneal que se llevó a cabo 3 o 4 semanas después.

Además de carprofeno, los ratones recibieron una única inyección de dexametasona (5 mg/kg, sc) para prevenir el edema cerebral. Se centró una pequeña craneotomía (3 mm) sobre V1. Se adelgazó una región exterior del cráneo adicional de 1 mm para que un cubreobjetos de vidrio de 4 mm (World Precision Instruments, Sarasota, FL) se asentara sobre el cerebro expuesto y se presionara contra el hueso adelgazado que rodea la craneotomía. Se usaron esponjas estériles GELFOAM (Patterson Veterinary) previamente empapadas en solución salina estéril para absorber el sangrado de la dura después de la extracción del cráneo. El vidrio se sujetó manualmente con pinzas y los bordes se fijaron al cráneo primero con una fina capa de Vetbond y luego con resina acrílica. No se utilizaron ratones con hemorragia operatoria o posoperatoria en el parénquima. Algunos ratones habían tenido hemorragia dural postoperatoria menor. El sangrado de la duramadre que no desaparecía por completo en tres días normalmente producía crecimiento óseo y poca claridad en las imágenes. Por lo tanto, los ratones fueron sacrificados si su sangrado postoperatorio no desaparecía dentro de los tres días.

Todas las grabaciones se realizaron en ratones despiertos con la cabeza fija sobre una superficie lisa de tableta. Todos los estímulos se presentaron en un monitor LED de 24 pulgadas con corrección gamma (Asus VG248, frecuencia de actualización de 60 Hz, 20 cd/m2), colocado a 25 cm de los ojos del ratón.

Las respuestas hemodinámicas se obtuvieron con un macroscopio SciMedia THT (Leica PlanApo 1,0 ×, 6,5 × 6,5 mm de área de imagen) equipado con un Andor Zyla sCMOS (30 fps). Se utilizó un controlador LED (DC4104 Thorlabs) para la iluminación. Primero, se capturó una imagen de referencia de la vasculatura superficial usando luz verde (530 nm). A continuación, la cámara se enfocó ~ 600 μm por debajo de la superficie del cráneo. Se insertó un filtro rojo en la ruta y se usó una luz roja (617 nm) para iluminar uniformemente V1. El estímulo presentado en todos los experimentos abarcó los 30° centrales del campo visual del ratón y consistió en un estímulo de ruido de barrido modulado por contraste periódicamente cada 20 s. Cada prueba de grabación consistió en 10 presentaciones a 0° y 180°. El estímulo se generó multiplicando una película de ruido espaciotemporal binarizado de banda limitada (< 0,15 cpd, < 4 Hz) con una máscara espacial gaussiana unidimensional (20°) utilizando secuencias de comandos de Python personalizadas.

La señal de calcio se detectó utilizando un microscopio resonante de dos fotones (Neurolabware) equipado con un objetivo de inmersión en agua Nikon 16x (NA = 0,8). La fluorescencia roja (tdTomato) y verde (GCaMP6s) se estimuló utilizando un láser Ti:Sapphire sintonizado a 900-920 nm (Mai Tai HP, Spectra-Physics). La adquisición de datos (10 Hz, 200–300 μm por debajo de las meninges) se controló mediante el software Scanbox (Neurolabware). Los estímulos visuales fueron generados por el software Python personalizado. Los estímulos consistieron en una condición en blanco (luminancia uniforme), una condición de parpadeo de campo completo (3 Hz) y rejillas sinusoidales a la deriva de campo completo (100 % de contraste) de 6 a 7 frecuencias espaciales (0,015 a 0,96, espaciadas logarítmicamente) y 12 direcciones (0°–330°, en pasos de 30°) a 3 Hz. Cada condición consistió en un estímulo visual de 1,5 s seguido de una pantalla gris uniforme de 1,5 s. Cada registro consistió en 10 ensayos y cada ensayo consistió en condiciones aleatorias. Los estímulos se presentaron a un ojo a la vez utilizando un oclusor. El orden de oclusión se eligió aleatoriamente para cada sesión.

Los ratones se perfundieron transcardiacamente primero con 1XPBS y luego con fijador (4% de PFA en 1xPBS). Los cerebros se extrajeron, se fijaron posteriormente y se crioconservaron en sacarosa al 30%. Se usó un micrótomo de congelación para cortar los cerebros en secciones de 50 µm de espesor. El inmunomarcaje fluorescente siguió una técnica indirecta estándar como se describió anteriormente62. Brevemente, las secciones flotantes se bloquearon en PBS suplementado con Triton X100 al 0,2 % (Sigma-Aldrich) y suero de cabra al 5 % (Sigma-Aldrich) y luego se incubaron con primario durante la noche a 4 °C. Las secciones de cerebro se tiñeron con anticuerpos primarios contra: molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1 (IBA1) (1:1000; nº de catálogo 019-19741, Wako). Se obtuvieron imágenes fluorescentes de alta resolución utilizando un microscopio confocal Leica TCS SPE-II y el software LAS-X. Para las imágenes confocales, se capturaron tres campos de visión (FOV) por región cerebral por ratón, a menos que se indique lo contrario. Los recuentos de células totales y los análisis de puntos se obtuvieron mediante imágenes de secciones comparables de tejido de cada animal en el objetivo de 20X o 63X, en múltiples planos z, seguidos de análisis automatizados utilizando puntos Bitplane Imaris 7.5.

Los mapas de amplitud de las respuestas corticales se extrajeron con análisis de Fourier a la frecuencia de repetición del estímulo107 utilizando el software personalizado MATLAB (MathWorks). Estos mapas se utilizaron para guiar la inyección de virus en bV1.

Se usó el código Matlab y Python escrito a medida para eliminar el artefacto de movimiento, colocar ROI de celda, extraer la señal de calcio y realizar análisis como se describió anteriormente51. Brevemente, las grabaciones se registraron utilizando un algoritmo eficiente que corrige los artefactos de traducción al minimizar la distancia euclidiana entre los fotogramas y una imagen de plantilla utilizando un enfoque de transformada de Fourier. Los ROI se colocaron primero manualmente para las neuronas excitatorias e inhibidoras. La señal de calcio somático en el tiempo t se determinó como Fsoma(t) = Fsoma(t) − (R × Fneuropil(t))88,93. Se determinó empíricamente que R era 0,8 comparando la intensidad de la señal de GCaMP6s en los vasos sanguíneos con la intensidad del neuropilo vecino. La señal del neuropilo Fneuropil(t) de cada célula se midió promediando la señal de todos los píxeles fuera de la célula y dentro de una región de aproximadamente 40 μm desde el centro de la célula.

Para determinar la respuesta de una célula a cada condición, la traza de calcio promedio de la ROI durante un estímulo visual se normalizó a la señal de calcio promediada durante los últimos 0,5 s de la pantalla gris anterior. La respuesta a una determinada orientación θi se definió como la respuesta promedio en 10 ensayos: F(θi). Para evaluar el ajuste neuronal, restringimos nuestro análisis a las neuronas que cumplieron con los dos criterios siguientes. En primer lugar, en cada frecuencia espacial, se determinó la capacidad de respuesta mediante un ANOVA unidireccional (p < 0,01) entre orientaciones frente a la condición en blanco. En segundo lugar, la respuesta evocada más fuerte tenía que estar por encima del ruido de calcio no evocado según lo determinado usando el estímulo en blanco: medio en blanco + (2xSDen blanco). La capacidad de respuesta de una célula se determinó para cada ojo por separado.

La frecuencia espacial máxima se determinó como la frecuencia espacial de la condición que provocó la respuesta de calcio más fuerte (Rmax). Para el análisis estadístico, solo se utilizó la frecuencia espacial máxima del ojo con la respuesta evocada más intensa. Las curvas de ajuste de frecuencia espacial de la población se calcularon primero para cada animal y luego se promediaron entre todos los ratones de dos maneras. En el primer método, las curvas de sintonización de frecuencia espacial se centraron alrededor de la frecuencia espacial máxima y se promediaron. En el segundo método, las curvas de sintonización de frecuencia espacial se promediaron sin cambiar las curvas.

La orientación preferida (θpref) se calculó a lo largo de la frecuencia espacial máxima, calculando la mitad de la media de los vectores direccionales ponderados por la respuesta F(θ) en cada orientación de la siguiente manera:

La selectividad de orientación se calculó en la frecuencia espacial máxima utilizando un método basado en la varianza circular de la siguiente manera:

Las celdas con valores OSI inferiores a 0 y superiores a 1 se excluyeron del análisis. Para el análisis estadístico, solo se utilizó la selectividad de orientación del ojo con la respuesta evocada más fuerte. Para cada ratón, se calculó una curva de ajuste de la orientación de la población centrando las curvas de ajuste alrededor de la orientación que provocó la respuesta más fuerte. Las curvas de ajuste de la población se promediaron en todos los ratones.

El índice de dominancia ocular se calculó de la siguiente manera:

donde C e I son las respuestas contralateral e ipsilateral más fuertes, respectivamente. Un ODI de -1 indica una célula que solo responde a la estimulación a través del ojo ipsolateral. Un ODI de 1 indica una célula que solo responde a la estimulación a través del ojo contralateral. Para las neuronas que solo respondían a la estimulación monocular, se usó la frecuencia espacial máxima a través del ojo que responde para extraer la señal de calcio más fuerte a través del ojo que no responde.

GraphPad Prism (GraphPad Software v9) se usó para las pruebas t de Welsch en la Fig. 1 y se usó un ANOVA unidireccional que controla la Tasa de descubrimiento falso con un método de configuración de dos etapas de la prueba Benjamini, Krieger y Yekutieli en las Figs. . 2 y 3. Se usaron rutinas personalizadas de Python para la prueba de ANOVA unidireccional para la capacidad de respuesta visual y los cálculos de selectividad relacionados en las Figs. 2 y 3. El trazado de datos se realizó utilizando scripts de Matlab y GraphPad Prism.

Los datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s41598-022-27362-w

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Descargar referencias

Departamento de Patología, Children's Hospital Boston, Boston, MA, 02115, EE. UU.

Dario X. Figueroa Velez

Departamento de Neurobiología y Comportamiento, Universidad de California, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Michael Arreola, Carey YL Huh, Kim Green y Sunil P. Gandhi

Centro de Neurobiología del Aprendizaje y la Memoria, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Kim Green y Sunil P. Gandhi

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DXFV fue apoyado por NIH F31 (EY028046). DXFV, MA y CYLH llevaron a cabo experimentos/análisis bajo la supervisión de SPG y KNGDXFV y SPG escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Sunil P. Gandhi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Vélez, DXF, Arreola, M., Huh, CYL et al. El agotamiento juvenil de microglia reduce la orientación pero no la selectividad de alta frecuencia espacial en el ratón V1. Informe científico 12, 12779 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15503-0

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Recibido: 24 febrero 2022

Aceptado: 24 junio 2022

Publicado: 27 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15503-0

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